彭春麗，黃 瑋，萬保羅，馬 嵩

(1.河南中醫(yī)學(xué)院 河南鄭州 450003;2.河南省衛(wèi)生廳 河南鄭州 450003;3.河南省人民醫(yī)院耳鼻喉科 河南鄭州 450003)

喉癌(carcinoma of the larynx)是耳鼻喉科常見的惡性腫瘤之一，占全身惡性腫瘤的1% ～5%，其病理上以鱗狀細(xì)胞癌多見。近年來發(fā)病率呈上升趨勢，其發(fā)病機制不完全清楚。c-met是一種由c-met原癌基因編碼的蛋白產(chǎn)物，為肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)受體，具有酪氨酸激酶活性。研究發(fā)現(xiàn)異常表達(dá)的c-met可以激活下游分子導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移。本研究旨在從蛋白水平觀察c-met在喉癌組織及非癌組織中表達(dá)情況，為進(jìn)一步深入研究喉癌的發(fā)生發(fā)展機制及腫瘤治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 研究對象 收集42例河南省人民醫(yī)院和鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院2008年至2009年手術(shù)切除的喉癌標(biāo)本，均有完整臨床資料，經(jīng)組織病理學(xué)均確診為喉鱗狀細(xì)胞癌?；颊咝g(shù)前均未接受化療或放療。其中男41例，女1例，年齡38～80歲，平均59歲，≥60歲18例，＜60歲24例。42例喉鱗癌TNM分期采用國際抗癌協(xié)會(UICC)1977年公布的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行:T分期:T1:3例，T2:17例，T3:17例，T4:5例。細(xì)胞分化程度:高分化:22例，中分化:14例，低分化:6例。臨床分期:Ⅰ期:3例，Ⅱ期:10例，Ⅲ期:22例，Ⅳ期:7例。頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組15例，無轉(zhuǎn)移組27例。另取25例非喉鱗癌組織(癌旁組織和聲帶息肉)作為對照組。

1.2 主要試劑 兔抗人c-met多克隆抗體購自博奧森生物技術(shù)公司。MaxVision試劑盒、濃縮型DAB試劑盒(DAB-0031)均購自邁新生物技術(shù)公司。

1.3 實驗方法 所有標(biāo)本均經(jīng)10%福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，4厚連續(xù)切片;拷片后脫蠟，梯度酒精水化，3%H2O2孵育10 min，高壓抗原修復(fù)20 min;MaxVision二步法進(jìn)行染色，DAB顯色，蘇目素復(fù)染，脫水，透明，中性樹脂封固。以磷酸鹽緩沖液代替一抗作陰性對照，陽性對照采用預(yù)實驗中已知陽性的喉鱗癌切片做陽性對照。

1.4 結(jié)果判斷 c-met陽性著色定位于細(xì)胞質(zhì)，陽性染色為棕黃色顆粒。采用雙盲法，每張切片隨機觀察5個高倍鏡視野(10×40)，每高倍鏡視野計數(shù)100個腫瘤細(xì)胞，計算陽性細(xì)胞百分率:陽性細(xì)胞＜5%為(－);陽性細(xì)胞在5% ～25%為弱陽性(+);陽性細(xì)胞數(shù)在25% ～50%為陽性(++);陽性細(xì)胞≥50%為強陽性(+++)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用采用應(yīng)用SPSS17.0版統(tǒng)計軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。兩組差異的比較用χ2檢驗和Fisher精確概率法，相關(guān)性分析用Spearman等級相關(guān)檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 c-met在LSCC、癌旁組織或聲帶息肉中的表達(dá)c-met陽性著色見于細(xì)胞質(zhì)，c-met在喉癌組織、非癌組織(癌旁組織及聲帶息肉)中均有表達(dá)，其陽性表達(dá)率分別為 64.3%、32.0%。見表 1。

表1 c-met在LSCC、非癌組織的表達(dá)

2.2 c-met在LSCC中表達(dá)與臨床病理特征間的關(guān)系 c-met在 T1、T2期喉癌中的陽性表達(dá)率與在T3、T4期LSCC中的陽性表達(dá)率有顯著性差異(P＜0.05);c-met在高、中、低分化LSCC三組間的陽性表達(dá)率有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05);c-met在Ⅰ ～Ⅱ期LSCC中的陽性表達(dá)率與在Ⅲ～Ⅳ期LSCC中的陽性表達(dá)率間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);c-met在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的陽性表達(dá)率與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的陽性表達(dá)率間有顯著性差異(P＜0.05)。c-met在喉癌中的陽性表達(dá)率與患者的年齡無關(guān)(P＞0.05)。見表2。

表2 c-met在LSCC中表達(dá)與臨床病理特征間的關(guān)系

3 討論

c-met是一種由c-met原癌基因編碼的蛋白產(chǎn)物，為肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)受體，具有酪氨酸激酶活性，編碼HGF受體，是細(xì)胞內(nèi)信息傳遞的重要組成成分。HGF激活c-met，導(dǎo)致多個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的級聯(lián)激活，細(xì)胞發(fā)生一系列生物學(xué)效應(yīng)，從而調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的增殖、分化、運動、侵襲以及最終轉(zhuǎn)移等［1］。在體內(nèi)，HGF主要由間質(zhì)細(xì)胞分泌，HGF與受體c-met結(jié)合將激活HGF/c-met信號通路，促進(jìn)腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移。研究表明c-met激活與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移有關(guān)。

原癌基因 c-met位于第7號染色體長臂7q31，大小約110 kb，包含21個外顯子和20個內(nèi)含子［2］，屬于酪氨酸激酶受體家族之一。其編碼9.0 kb mRNA，編碼的前體蛋白分子量為140 kD，經(jīng)糖基化作用產(chǎn)生170 kD的糖蛋白，進(jìn)而切割成50 kD的α亞基和145 kD的β亞基，兩個亞基以二硫鍵相形成190 kD的成熟受體蛋白，位于細(xì)胞膜上，β亞基有胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)，N末端部分為暴露于細(xì)胞表面的配體結(jié)構(gòu)域，C末端部分位于胞漿內(nèi)。α亞基只有胞外部分，借助于二硫鍵附于β亞基上。α和β亞基的胞外區(qū)是配體識別部位 ，可以識別并結(jié)合肝細(xì)胞生長因子(HGF)，而胞內(nèi)區(qū)具有酪氨酸激酶活性 ，是多種信號分子相互作用的結(jié)合部，該受體蛋白具有經(jīng)典的信號肽序列、細(xì)胞外位點結(jié)構(gòu)、跨膜位點結(jié)構(gòu)以及酪氨酸激酶位點結(jié)構(gòu)［3，4］。正常表達(dá)的 c-met對胚胎的生長發(fā)育、組織的再生、傷口的愈合等起著重要的作用。Bussolino［5］等研究證明血管內(nèi)皮細(xì)胞能表達(dá)c-met，HGF能夠刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和參與內(nèi)皮細(xì)胞損傷的修復(fù)機制。同時，Huriguchi［6］等研究也證明HGF不僅可以通過自分泌或旁分泌途徑直接作用于內(nèi)皮細(xì)胞，而且促使其他血管生長因子的水平升高(如VEGF)，間接促進(jìn)腫瘤血管生成導(dǎo)致腫瘤生成與轉(zhuǎn)移。除此之外，HGF/c-met還能增加內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)血管生成反應(yīng)的介質(zhì)包括VEGFR2RTK［7］。在肝細(xì)胞癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、乳腺癌肺癌中研究發(fā)現(xiàn)，HGF/c-met的表達(dá)與毛細(xì)血管密度(microvessel density)呈正相關(guān)［8］。研究還發(fā)現(xiàn)，HGF可以促進(jìn)多種腫瘤細(xì)胞的運動能力。Royal［9］等對MDCK上皮細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)，HGF可以影響上皮細(xì)胞與間質(zhì)的相互作用，導(dǎo)致上皮細(xì)胞的分離和擴(kuò)算，這在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中極為重要。C-met的異常激活還可增加腫瘤細(xì)胞對細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的降解。眾多研究也證明，c-met蛋白在多種惡性腫瘤中表達(dá)異常，如肝細(xì)胞癌、腎癌、乳腺癌、胃癌、宮頸癌、結(jié)腸癌等，且表達(dá)的水平與腫瘤的惡性程度呈正相關(guān).說明c-met與多種惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［10，11］。

本實驗應(yīng)用敏感的MaxVision免疫組化二步法檢測了c-met蛋白在喉鱗癌及非癌組織中的表達(dá)。在本實驗研究結(jié)果中，c-met在LSCC中的陽性表達(dá)率為64.3%，而在25例對照組的表達(dá)率為32.0%，兩組間的陽性表達(dá)率有顯著性差異(P＜0.05)，有顯著統(tǒng)計學(xué)意義，表明c-met在喉鱗癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。這與 Sawatsubashi［12］的實驗結(jié)果相符。在 T1、T2期喉癌中的c-met陽性表達(dá)率為45.0%，而在 T3、T4期LSCC中的陽性表達(dá)率為81.8%，兩組有顯著性差異(P＜0.05);c-met在Ⅰ～Ⅱ期LSCC中的陽性表達(dá)率為38.5%，在Ⅲ～Ⅳ期LSCC中的陽性表達(dá)率為75.9%，兩組間有差異(P＜0.05)，且隨著T分期與臨床分期的進(jìn)展，c-met蛋白陽性表達(dá)呈上升趨勢，;cmet在高、中、低分化LSCC中的陽性表達(dá)率分別為45.5%、78.6%、100.0%，3 組間有顯著性差異(P ＜0.05)，喉鱗癌細(xì)胞分化程度越高，c-met蛋白的陽性表達(dá)越低;c-met在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的陽性表達(dá)率為86.7%，在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的陽性表達(dá)率為51.9%，兩組間有顯著性差異(P＜0.05)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者。這與大多數(shù)研究結(jié)果一致，龔健靈等［13］利用免疫組化法檢測喉鱗癌中c-met表達(dá)率為62.2%，明顯高于癌旁正常組織的16%;c-met蛋白的表達(dá)與喉癌的臨床分期、病理學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有顯著差異(P＜0.05)。王冰等［14］利用免疫組化檢測46例喉鱗癌與25例正常喉粘膜中c-met的表達(dá)情況，結(jié)果顯示c-met在喉鱗癌中高表達(dá)，c-met表達(dá)與臨床分期、病理分級及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)。這些結(jié)果提示c-met蛋白在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，因此阻斷HGF/C-met系統(tǒng)的配對表達(dá)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可作為抗腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移治療的策略之一。

［1］ Daveau M，Scotte M，F(xiàn)rancois A，et al.Hepatocyte factor，transforming growth factor alpha，and their receptors as combined markers of prognosis in hepato cellular carcinoma［J］.Mol Carcinog，2003，36:130-141.

［2］ Bottaro D，Rubin J，F(xiàn)aletto D，et al.Identification of the hepatocyte growth factor receptor as the c-met proto-oncogene product［J］.Science，1991，251(4995):802-804.

［3］ Liu Y .The human hepat ocyte growth factor receptor gene:complete structural organization and promoter characterization［J］.Gene，1998，215(1):159-169.

［4］ 紀(jì)靜，趙鵬，黃葆華.胃癌組織中增殖細(xì)胞核抗原表達(dá)及 c-met基因異常的實驗研究［J］.衛(wèi)生研究，2008，37(4):479.

［5］ Bussolin F，Di Renzo M F，Ziche M，et al.Hepatocyte growth factor is a potent angiogenic factor which stimulates endothelial cell motility and growth［J］.J CelL Biol，1992，119(3):629-641.

［6］ Horiguchi N，Takayama H，Toyoda M，et al.Hepatocyte growth factor promotes hepatocarcinogenesis through c-Met autocrine antivation and enhanced angiogenesis in transgenic mice treated with diethylnitrosamine［J］.Oncogene，2002，21:1791-1799.

［7］ Wojta J，Kaun C，Breuss J M，et al.Hepatocyte growth factor increases expression of vascular endothelial growth factor and plasminogen activator inhibitor-1 in human keratinocytes and the vascular endothelial growth factor receptor flk-1 in human endothelial cells［J］.Lab Invest，1999，79(4):427-438.

［8］ Christensen J G，Burrows J，Salgia R.C-Met as a target for human cancer and characterization of inhibitors for therapeutic intervention［J］.Cancer Letters，2005，225(1):1-26.

［9］ Royal I，Lamarche-Vane N，Lamorte L，et al.Activation cdc42，rac，PAK，and rho-kinase in response to hepatocyte growth factor differentially regulates epithelial cell colony spreading and dissociation［J］.Mol Biol Cell，2000，11(5):1709-1725.

［10］ Yoshjda s，Hamda T，Lwabe T，et al.Induction of hepatocyte growth factor enhances growth factor in stmmal cells by tumor-derived basic fibrobIast factor enhances growth and invasion of endomentrid cancer［J］.J Clin Endocrinol Metab，2002，87(5):2376-2383.

［11］ Knowles L M，Stabile L P，Egloff A M.et al.HGF and c-Met paticipate in pararrino tumorigenic pathways in head and neck squamous ceIl cancer［J］.Clin Cancer Res，2009，15(11):3740-3750.

［12］ Sawatsubashi M，Sasatomi E，Mizokami H，et al.Expression of c-met in laryngeal carcinoma［J］，Virchows Arch，1998，432(4):331-335.

［13］龔健靈，徐潔潔，喬明哲，等.C-met和MMP-9在喉鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及意義［J］.江蘇醫(yī)藥，2008，4(34):357-359.

［14］王冰，姬長友，關(guān)力謙，等.肝細(xì)胞生長因子及其受體c-Met在喉鱗狀細(xì)胞癌腫的表達(dá)［J］.重慶醫(yī)學(xué)，2007，3(36):202-206.