徐赤宇 劉翠杰 吳建華 仇蕓 趙瑾 朱紅梅 溫海

(1.濟南軍區(qū)總院皮膚科，濟南 250031;2.第二軍醫(yī)大學附屬長海醫(yī)院皮膚科，上海 200433;3.第二軍醫(yī)大學附屬長征醫(yī)院皮膚科，上海 200003)

新生隱球菌 (C.neoformans)是具有莢膜的擔子類酵母菌，首先通過呼吸道進入肺部，當宿主免疫力低下時播散入血，最終導致隱球菌性腦膜炎或腦膜腦炎，有很高的死亡率［1］。近些年來基因技術的廣泛應用，使新生隱球菌的致病機理的研究達到了一個更新更深的層次，而基因技術的關鍵是分離到純凈、完整的高質量生物RNA，對于進行相關的致病性基因表達分析研究致關重要［2］。新生隱球菌具有一般真菌所具有的細胞壁以外，還有一般真菌所不具有的厚莢膜，厚莢膜具有防御和抵抗吞噬的特性，通常占整個菌體細胞體積的70%［3］。

常規(guī)提取核糖核酸的方法是用酶消化細胞壁和莢膜形成原生質體后再破壁抽提，而這個過程往往比較繁瑣;在所有的RNA實驗中，實驗失敗的主要原因是核糖核酸酶(RNase)的污染和RNA的降解。目前常用的破壁方法包括:熱酸性酚裂解法破壁酶、液氮破壁、酸洗玻璃珠破壁和微波破壁方法［4］以及異硫氰酸胍聯(lián)合玻璃珠法快速抽提DAN和RNA［5］等。因為考慮到酶與細胞孵育影響RNA的質量，熱酸性酚裂解法RNA提取率低以及微波破壁致大量RNA分子斷裂等特點［6-8］，本實驗設計了4種RNA提取方法進行對照試驗，現(xiàn)將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株來源 新生隱球菌H99(由美國NIH KwonChung教授惠贈);新生隱球菌Cap60無莢膜突變株 (美國 McGurire Veterans Administration Medical Center，Richmonel，Virginia 23249 的 ES.Jacobson教授惠贈)。

儀器和試劑 ULTROSPEC2100型紫外可見光分光光度儀 (美國 Biochrom Ltd公司);Gel DOC2000凝膠成像分析系統(tǒng) (美國BD RAD公司);U-3000 Spectrophometer(日本島津公司);Perkoin-Elmer Cetus9600 thermal Cycler(美國 PE公司);TES溶液，含 10 mmol/L Tris-HCl、10 mmol/L EDTA、5%SDS(pH7.5);溶液 D(4 mol/L異硫氰酸胍、25 mmol/L檸檬酸鈉、0.5%Sarcosyl、0.1 mol/Lβ-巰基乙醇);0.45 ～ 0.55 mmol/L Glass beads，Dithiothreitol(DTT)(Singa 公司);RNA 緩沖液，含 10 mmol/L NaCl、200 mmol/L Tris-HCl、10 mmol/L EDTA、pH7.5;YPD 培養(yǎng)基(2%蛋白胨，2%葡萄糖，1%酵母抽提物);酸性酚;玻璃珠法抽提緩沖液 (100 mmol/L Tris-HCl pH8.0，10 mmol/L EDTA pH8.0，5 mmol/L DTT，100 mmol/L NaCl，1%SDS);Yeast RNA kit提取試劑 (OMEGA公司)。RT-PCR kit(TaKaRa);定量PCR檢測引物由上海生工合成。羅氏LightCycler 1.5定量PCR儀。

1.2 方法

菌株的培養(yǎng)和裂解 菌株接種到固體沙堡氏培養(yǎng)基斜面上，充分活化3 d后移種一整環(huán)菌株于裝有100 mLYEPD培養(yǎng)基250 mL三角燒瓶中，30℃振蕩培養(yǎng) (200 r/min)16 h，取1 mL菌液離心收集菌體 (5 000 r/min 5 min)，用雙蒸水洗滌2次后重新離心收集菌體 (5 000 r/min 5 min)，每mL菌量約為9×109個。

莢膜菌株和莢膜缺陷株總RNA提取 嚴格操作規(guī)程，防止RNA酶的污染。

酸洗玻璃珠法 1 mL YEPD菌體培養(yǎng)液置于1.5 mL管中，10 000 r/min離心2 min收集菌體;用雙蒸水洗滌兩次，同法離心，棄上清液;加入RNA緩沖液重懸，加入200 μL的玻璃珠抽提緩沖液，充分混勻，置于37℃搖床孵育10 min;加入等體積的酸洗玻璃珠酸洗玻璃珠200 μL，高速振蕩1 min，冰浴30 s，重復5 ～6 次，加入400 μL 不含1%SDS的玻璃珠抽提緩沖液，手搖混勻;12 000 r/min離心2 min，將上清夜轉至另一干凈的管中;再加入等體積的酚/氯仿，手搖混勻;12 000 r/min離心10 min;取上清再以等體積的氯仿同法離心1次;加入1/10體積的3 mol/L NaAc(pH5.2)和等體積的異戊醇，來回顛倒數(shù)次混勻，-20℃放置20 min;室溫下12 000 r/min離心10 min，棄上清液，沉淀以70%的冷乙醇洗滌3次，風干后加入適量的DEPC水重溶，-20℃貯存。

液氮研磨法 將上述含有9×109菌體細胞的試劑移入-20℃的50 mL瓷研缽中，加入液氮研磨至糊狀物后移到新試管中［9］。將破壁后的試劑置于37℃搖床孵育10 min;加入氯仿，在旋渦混合器上高速劇烈振蕩2 min。室溫靜置10 min，使得核酸蛋白復合物充分完全分離;4℃ 13 000 r/min離心10 min，取上層水相到新離心管中加入異丙醇沉淀RNA;75%乙醇洗滌沉淀，干燥;加入20 μL的DEPC處理過去離子水溶解RNA，-80℃貯存。

異硫氰酸胍一步法 參見文獻［10］方法抽提總RNA。

冷酸洗玻璃珠聯(lián)合Yeast RNA kit法 收取到的菌體細胞約9×109，經(jīng)冰冷的無RNase水重懸離心，棄上清液后各加入200 μL 的直徑0.45～0.55 mm玻璃珠抽提緩沖液，充分混勻，置于37℃搖床孵育10 min;加入等體積的酸洗玻璃珠酸洗玻璃珠200 μL，同時加入1 mL Yeast RNA kit提取試劑，加入400 μL不含1%SDS的玻璃珠抽提緩沖液，手搖混勻，在旋渦混合器上高速劇烈振蕩2 min。室溫靜置10 min，使得核酸蛋白復合物充分完全分離;4℃ 13 000 r/min離心10 min，棄上清液。

總RNA定性和定量分析 每種方法重復5次，將上述抽提的RNA經(jīng)純化后稀釋50倍，RNA的純度分別用紫外分光光度計測定樣品A260/A280比值，根據(jù)公式計算RNA濃度 (μg/mL)=A260×50 μg×稀釋倍數(shù)×樣品總體積，RNA總濃度 (μg/9×109)=20×RNA濃度 (μg/μL)。

總RNA的完整性分析 取5 μL RNA加1 μL溴酚蘭，加入1.2%瓊脂糖凝膠的加樣孔中，電壓110 mV，電流400 mA，緩沖液1×TAE電泳10～15 min，用凝膠成像系統(tǒng)對RNA進行完整性分析。

統(tǒng)計學分析 用SPSS 13.0軟件采用SNK檢驗進行不同方法之間的兩兩比較。

2 結 果

2.1 墨汁涂片及培養(yǎng)

每種方法破壁后墨汁涂片檢查及培養(yǎng) 鏡檢時見大量細胞碎片，但是發(fā)現(xiàn)少量的未完全破壁的新生隱球菌，培養(yǎng)均未見生長。

2.2 RNA的定性定量結果和結論(見表1)

對4種方法提取的新生隱球菌菌體細胞的RNA濃度進行SNK檢驗分析發(fā)現(xiàn)，酸洗玻璃珠法和液氮研磨法比較的q=2.74(P＞0.05);酸洗玻璃珠法和異硫氰酸胍一步法兩組比較的q=6.85(P＜0.01);酸洗玻璃珠法和冷酸洗玻璃珠聯(lián)合Yeast RNA kit法兩組比較的 q=9.65(P＜0.01);液氮研磨法和異硫氰酸胍一步法兩組比較的q=4.02(P＜0.05);液氮研磨法和冷酸洗玻璃珠聯(lián)合Yeast RNA kit法兩組比較的q=6.42(P＜0.01);異硫氰酸胍一步法和冷酸洗玻璃珠聯(lián)合Yeast RNA kit法兩組比較的 q=6.37(P＜0.01)。結果表明酸洗玻璃珠法和液氮研磨法提取的RNA量無差別;酸洗玻璃珠法、液氮研磨法和冷酸洗玻璃珠聯(lián)合Yeast RNA kit法提取RNA量明顯優(yōu)于異硫氰酸胍一步法;冷酸洗玻璃珠聯(lián)合Yeast RNA kit方法最佳。

用t檢驗對用冷酸洗玻璃珠聯(lián)合Yeast RNA kit法提取的莢膜株和莢膜缺陷株總 RNA濃度(μg/9×109)進行比較，得出P＜0.01，說明用無莢膜株提取RNA產(chǎn)量明顯高于有莢膜株，說明厚莢膜對抽提RNA有影響。

2.3RNA完整性分析 (見圖1)

A泳道無5SrRAN的條帶，B、C、D泳道三條都有，B和C泳道的25S、18S條帶亮度比值約為2，而D泳道的25S、18S條帶亮度比值約為4，說明酸洗玻璃珠法和液氮研磨法比異硫氰酸胍一步法提取的RNA完整性好，但是冷酸洗玻璃珠聯(lián)合Yeast RNA kit法提取的RNA比其他3種方法更好。

2.4 RT-PCR后定量PCR鑒定RNA質量

以引物對新生隱球絲氨酸蛋白酶相關基因的一段編碼序列，引物由上海生工合成，絲氨酸蛋白酶基因檢測引物序列如下:F.＇-AACTCCACCACAAACACCA-3 ＇;R.5 ＇-GGAAAGACTCAGTCCCGTAA-3＇。actin 基因檢測引物序列如下:F.5＇-GCCCTTGCTCCTTCTTCTAT-3 ＇;R.5 ＇-GACGATTGAGGGACCAGACT-3＇。反應體積:20 μL;反應條件:95℃5 s;55℃ 10 s;72℃ 15 s;76℃讀取熒光值，40個反應循環(huán)。結果顯示4種方法提取的RNA都可以進行定量PCR檢測，取相同量RNA進行定量PCR檢測，冷酸洗玻璃珠聯(lián)合Yeast RNA kit法的Ct值最小(見表1)，說明這種方法提取的RNA完整性最好，定量PCR檢測的擴增曲線見圖2。

表1 4種提取方法提取RNA的定量PCR檢測Tab.1 RT-PCR Detection results in 4 RNA Extraction Methods

3 討 論

在與致病性微生物例如細菌、病毒及同屬真菌擔子類酵母菌白念珠菌等分子生物學研究領域相比較，目前對抽提新生隱球菌RNA并對其進行致病性調控基因方面的研究很匱乏。原因之一可能是新生隱球菌單個致病性酵母細胞中所含的RNA的量非常少，加之新生隱球菌具有占有其體積70%的厚壁莢膜和細胞壁的雙重屏障作用，給提取RNA帶來一定的困難［11］。當前國內外雖然有文獻報道提取新生隱球RNA，但是方法較為繁瑣和不便捷，RNA提取的關鍵是破壁，早期的真菌破壁一般采用液氮冷凍研磨，超聲破壁或冷凍干燥研磨，由于劇烈的機械損傷，而導致大量的RNA分子斷裂［8］。后來有相繼發(fā)展了傳統(tǒng)的熱酸性酚裂解法破壁酶、液氮破壁、酸洗玻璃珠破壁和微波破壁方法［12］雖然取得了較好的效果，但是都易出現(xiàn)RNase的污染和 RNAD降解。目前利用 Trizol法［13］或Tripure法提取各類細胞RNA較為流行，可是因為含有裂解液和變性液等成分，以及擔子菌類酵母菌細胞壁的特殊結構，提取過程中不能充分破壞細胞壁，提取的總RNA存在不同程度的降解。另外植物組織和真菌組織比動物組織更為復雜，存在有內源RNase降解RNA問題，許多植物和真菌中含有大量雜質如多糖、多酚等，因為這些雜質分子與RNA有一些相似性，可與RNA同時沉淀或者吸附，因此在植物和真菌組織的提取中，需要用一些特別的步驟或者特別的試劑來去除多糖、多酚等雜質的干擾和污染。本課題組總結上述方法的不足，加以改進，首先利用冷酸洗玻璃珠機械振蕩充分破壞新生隱球菌雙重屏障，破壞細胞壁的二硫酸鍵獲得較高的原生質體，使得RNA全部釋放出來，再使用商品化專門針對酵母菌Yeast RNA kit進行常規(guī)的物理分離，使得核酸蛋白復合物完全分離，提取步驟簡便、快捷，整個反應過程1h內即可完成，提取的RNA產(chǎn)量、純度、完整性完全可滿足高質量分子生物學研究需要。1×109CFU/mL菌體所獲RNA量足夠做PT-PCR之用;玻璃珠經(jīng)反復洗滌可以重復利用，亦節(jié)省實驗經(jīng)費。在上述幾種抽提方法中，對所用菌株均取對數(shù)生長期的細胞為宜，菌齡老化的細胞嚴重影響RNA的得率。

圖1 RNA電泳結果:A.異硫氰酸胍一步法，B.酸洗玻璃珠法，C.液氮研磨法，D.冷酸洗玻璃珠聯(lián)合Yeast RNA kit法 圖2 Real-time PCR結果:A.異硫氰酸胍一步法，B.酸洗玻璃珠法，C.液氮研磨法，D.冷酸洗玻璃珠聯(lián)合Yeast RNA kit法(β-actin組)，E.異硫氰酸胍一步法，F(xiàn).酸洗玻璃珠法，G.液氮研磨法，H.冷酸洗玻璃珠聯(lián)合Yeast RNA kit法 (絲氨酸蛋白酶組)Fig.1 RNA Electrophoresis Results:A.Single-step by isothiocyanate guanidine，B.Glass bead method by acid washing，C.Liquid nitrogen grinding，D.Glass bead method by cold acid washing combined with Yeast RNA Kit Fig.2 Results of Real-time PCR:A.Single-step by isothiocyanate guanidine，B.Glass bead method by acid washing，C.Liquid nitrogen grinding，D.Glass bead method by cold acid washing combined with Yeast RNA Kit(Beta-actin group)，E.Single-step by isothiocyanate guanidine，F(xiàn).Glass bead method by acid washing，G.Liquid nitrogen grinding，H.Glass bead method by cold acid washing combined with Yeast RNA Kit(Serine Protease group)

實驗中可以發(fā)現(xiàn)破壁提取新生隱球菌RNA的方法以冷酸洗玻璃珠聯(lián)合Yeast RNA kit法最好，酸洗玻璃珠法和液氮研磨法次之，而異硫氰酸胍一步法很少。說明玻璃珠通過延長破壁振蕩時間可以充分提高破壞酵母相真菌細胞壁效率，其操作簡便，需時短于其他破壁方法。總之，提取RNA的方法很多，各有優(yōu)缺點，實驗室可以根據(jù)實驗的目的、要求、實驗條件、組織性質和RNA完整性的要求選擇破壁和提取方法，根據(jù)我們的實驗結果，酸洗玻璃珠聯(lián)合Yeast RNA kit法是提取致病性酵母菌新生隱球菌RNA的有效方法，既可以減少樣品間交叉污染又可以減少靶RNA丟失?？梢赃m用于大規(guī)模、高產(chǎn)量、高質量地抽提隱球菌RNA和用于RTPCR分析之用。

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