汪長中 邵菁 汪天明 程惠娟

(安徽中醫(yī)學院中西醫(yī)結合臨床學院，合肥230038)

近年來，隨著廣譜抗生素、免疫抑制劑的廣泛應用，導管插管、腹膜透析、器官移植、腫瘤放化療等的大量開展，以及艾滋病患者的不斷出現(xiàn)，免疫功能抑制人群逐漸增多，以念珠菌為主的真菌感染發(fā)生率呈逐年上升趨勢。據(jù)報道，在院內獲得性感染中，念珠菌引起的感染在血源性感染中位居第四位，在導管相關性感染中居第三位，即便使用了抗真菌藥物，其死亡率仍高達40%。在所有念珠菌感染中，以白念珠菌 (Candida albicans)感染率最高，占45%［1］。白念珠菌病已經(jīng)成為影響人類生活質量、威脅生命健康的重要疾病之一。白念珠菌所引起的慢性難治性感染目前認為與生物被膜形成密切相關。

白念珠菌生物被膜(biofilm)是白念珠菌附著于活體組織或非活體組織表面、由自身產生的基質(matrix)-胞外多聚化合物 (extracellular polymeric substances，EPS)包裹的有一定結構和功能的菌細胞群體，它是菌細胞在長期進化過程中所表現(xiàn)出的為適應環(huán)境壓力而形成的與浮游菌(planktonic)迥然不同的另一種生存方式。典型的白念珠菌生物被膜結構表現(xiàn)為基底數(shù)層酵母相細胞黏附于物體表面，其上方有豐富的基質覆蓋，內有大量菌絲生長，被膜厚度可達50～350 μm［2-3］(見圖1)。生物被膜狀態(tài)的白念珠菌不僅各種表型如形態(tài)結構、生理生化特性、致病性、對藥物的敏感性等與浮游狀態(tài)菌有顯著差異，其基因型也與后者有所不同［4］。生物被膜不同于懸浮菌的諸多特征與其所含的基質密切相關，基質不僅參與生物被膜結構組成，還可幫助被膜菌逃逸機體免疫系統(tǒng)的攻擊以及對抗藥物的抑制或殺傷，且可通過酶降解EPS造成被膜菌在體內播散從而造成慢性、難治性感染，同時基質也是抗生物被膜感染的靶點，抑制其合成或促使其降解即可抑制或破壞生物被膜。因此，對基質的研究逐漸成為近年來生物被膜領域的熱點之一。本文現(xiàn)就近年來白念珠菌生物被膜基質的研究進展作一綜述。

圖1 掃描電鏡下白念珠菌生物被膜基質 (箭頭指示處)［3］Fig.1 Scanning electron micrograph of biofilm formation of C.albicans(Arrows indicate matrix material)

1 生物被膜基質的概念及組成特點

生物被膜基質 (biofilm matrix)是由菌細胞分泌的黏性的胞外多聚化合物(EPS)，EPS再將菌細胞包裹于其中進而形成生物被膜。在生物被膜中，菌體本身所占比重不超過生物被膜干重的10%，而基質則超過90%［5］。生物被膜基質由多種成分組成，主要包括:

1.1 多糖

多糖是基質EPS的重要組分，分子量一般在(0.5～2)×106，電鏡下呈細線狀，黏附至菌細胞表面并形成網(wǎng)絡結構，基質缺乏會造成生物被膜成熟障礙［5］。Lal等［6］用色譜技術分析出白念珠菌生物被膜基質中含有一大約300 kDa的水溶性胞外多糖，由葡萄糖、甘露糖、鼠李糖和N-乙酰氨基葡萄糖組成。Al-Fattani等［3］在比較白念珠菌與熱帶念珠菌生物被膜基質組分及其耐藥性關系時，證實白念珠菌生物被膜基質中糖類占39.6%，其中葡萄糖含量最高，占32.2%，另有少量甘露糖、半乳糖等。由葡萄糖聚合而成的β-1，3-葡聚糖是白念珠菌生物被膜基質的重要組分。

1.2 蛋白

基質中的蛋白有些具有酶活性，能降解多糖、蛋白、核酸、纖維素、幾丁質、脂質等多聚物，所形成的低分子量降解產物可以作為碳源和氮源提供給被膜內菌;有些酶對于結構性EPS的降解可以促進被膜內菌細胞播散 (dispersion);還有些酶在生物被膜致病過程中作為毒力因子。有些則為結構蛋白，如糖結合蛋白(凝集素)參與了多糖基質網(wǎng)絡結構的形成及穩(wěn)定，并將菌細胞表面與EPS連接起來。Thomas等［7］應用蛋白組學技術比較了白念珠菌生物被膜和懸浮菌的蛋白組成方面的異同，發(fā)現(xiàn)兩者的蛋白表達譜高度相似，并進一步鑒定出數(shù)個差異表達蛋白，同時證實這些差異蛋白具有代謝酶活性(此前被稱為細胞表面蛋白和免疫優(yōu)勢抗原)。就蛋白組分而言，生物被膜基質中的蛋白質可以分為兩類:一類是分泌蛋白組(secretome)，如幾丁質酶活性的Cht3p，具有免疫調節(jié)功能的甘露糖蛋白Mp65和作為細胞表面抗原及黏附素的Mp58/Pra1p等。另一類則為非分泌蛋白，包括糖酵解酶、生物合成酶、線粒體蛋白等。

1.3 核酸

研究證實，胞外脫氧核糖核酸 (extracellular DNA，eDNA)是銅綠假單胞菌、葡萄球菌等細菌生物被膜EPS中的重要組分，那么eDNA是否也是白念珠菌生物被膜EPS的重要組分呢?Martins等［8］構建了流動狀態(tài)下生物被膜模型，檢測白念珠菌生物被膜 EPS中eDNA的存在及其含量、DNA酶(DNase)干預效果、加入外源性DNA對生物被膜形成的影響等，結果證實生物被膜基質中eDNA的存在。在96孔板中所構建的靜態(tài)生物被膜中，加入外源性DNA(＞160 ng/mL)能提高整個生物被膜的生物量 (biomass)，而加入 DNA酶 (＞0.03 mg/mL)后生物量則在生物被膜形成后期減少，充分表明eDNA在生物被膜結構組成及形成過程中的作用，是構成白念珠菌生物被膜基質的重要組分。至于eDNA是如何產生的，可能既有菌體裂解后所釋放的，也不排除菌細胞主動分泌的。

1.4 脂質

相對于其他成分研究來說，目前基質中脂質成分的研究不多。Conrad等［9］通過超聲和陽離子交換技術對兩種能進行污水處理的植物標本分析，發(fā)現(xiàn)該類標本的EPS中含有1.8%的脂質，后者包括磷脂、糖脂等。白念珠菌生物被膜ECM中的脂質性質及其含量有待于研究。

1.5 水

水在基質中是含量最高的成分，Marshall將生物被膜稱為“黏稠的水”(stiff water)。因基質能提供高度水合環(huán)境，故比周圍環(huán)境干燥的速度要慢很多。基質的吸濕性是通過保留水分而并非通過水結合機制完成的［4］。

2 生物被膜基質的功能

與細菌或其他真菌一樣，白念珠菌的生物被膜基質也具有多種功能，主要表現(xiàn)在:①介導黏附:黏附是生物被膜形成的第一步，通過基質的黏附使得菌細胞黏附在生物或非生物介質表面從而啟動生物被膜形成的早期階段。②形成并維持生物被膜結構:被膜內菌被基質直接包裹，基質的性質與含量會影響到被膜的三維結構及形成過程。③保護被膜菌并參與耐藥:被膜內的基質有助于被膜菌不僅對抗熱、紫外線等理化因素的影響，還能對抗機體特異性或非特異性免疫應答、以及藥物的殺傷，是導致被膜菌實現(xiàn)免疫逃逸及產生耐藥性的重要因素［10］。④具有酶活性:基質中的某些蛋白具有酶活性，能降解細胞外大分子營養(yǎng)物為被膜菌提供營養(yǎng)，并能降解結構性EPS使得細胞從生物被膜中分散出來引發(fā)新的定植及感染灶。⑤提供營養(yǎng):基質EPS被酶降解后所釋放的碳源、氮源、磷等化合物可以提供給被膜內菌在營養(yǎng)受限時再利用。⑥其他:促進生物被膜內菌細胞間的基因水平轉移;保持水合環(huán)境以延長菌細胞在缺水環(huán)境中的生存時間等［4］。

3 白念珠菌生物被膜基質的影響因素

白念珠菌生物被膜基質的產生受到諸如生長狀態(tài)、菌株性質、培養(yǎng)基種類等多種因素影響。Hawser等［11］比較了白念珠菌生物被膜在靜止與振搖兩種狀態(tài)下基質的產生，通過檢測生物被膜干重、XTT檢測代謝及放射性同位素吸收并結合掃描電鏡檢查等多種方法，證實白念珠菌生物被膜生長及其基質的產生量與菌生長狀態(tài)密切相關，在動態(tài)下被膜生長及其基質產生量要超過靜止狀態(tài)下，且在一定范圍內隨著搖床轉速提高，基質產生量也相應增多。Martins等［8］的實驗顯示，基質中有關組分含量及比例與菌生長所用的培養(yǎng)基密切相關，eDNA含量、蛋白含量、eDNA/蛋白含量之比以在RPMI-1640培養(yǎng)基中生長的最高，酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 (YPD培養(yǎng)基)次之，YNB最少。另外，溫度等條件也會對基質的組分如多糖、eDNA、蛋白等含量產生影響;同一菌株體內與體外生物被膜基質的產生也會有差異;再者，即使在相同生長條件下，不同菌株因異質性所產生的生物被膜基質也有一定差異。

4 白念珠菌生物被膜基質的調節(jié)

白念珠菌生物被膜基質及其一些重要組分的合成受到相應基因或蛋白的調控。

4.1 EFG1 和 BCR1

EFG1和BCR1分別是誘導白念珠菌形態(tài)發(fā)生和生物被膜形成的轉錄調節(jié)蛋白，Nobile等［2］證實，efg1/efg1與bcr1/bcr1缺失突變株難以形成生物被膜。Harriott等［12］在小鼠陰道接種efg1/efg1突變株，共聚焦顯微鏡下發(fā)現(xiàn)該突變株只能產生酵母相細胞與假菌絲而不能產生基質，故不能形成生物被膜，而互補菌株 (efg1/efg1+p EFG1)的生物被膜形成則恢復到與野生株相似的水平;在陰道的bcr1/bcr1突變株雖然能產生少量假菌絲，但掃描電鏡下難以見到基質以及光滑清晰的菌細胞形態(tài)，而互補菌株(bcr1/bcr1+p BCR1)則能形成生長旺盛且富含基質的生物被膜。上述結果足見EFG1和BCR1在生物被膜形成以及產生基質過程中的重要作用。

4.2 Zap1

Zap1是白念珠菌鋅缺乏反應調節(jié)蛋白，參與鋅代謝。Nobile等［13］比較了 zap1/zap1缺失突變株、zap1/zap1+p ZAP1互補菌株和ZAP1/ZAP1參考菌株之間的生物被膜及基質形成的異同，結果體內外生物被膜的β-葡聚糖及生物量，zap1/zap1突變株明顯高于互補菌株和參考菌株，表明Zap1對于白念珠菌生物被膜及其基質起抑制作用。隨后進一步探討了 Zap1靶基因 (ZRT2，ZRT1，PRA1，CSH1和IFD6)對生物被膜基質主要組分可溶性β-1，3-葡聚糖的調控作用，他們在突變菌株中引入高表達TDH3啟動子序列替代上述靶基因的啟動子區(qū)域，結果證實TDH3-CSH1和TDH3-IFD6兩種轉化子中的可溶性β-1，3-葡聚糖水平顯著下降，其他轉化子無明顯變化，表明CSH1和IFD6基因為β-1，3-葡聚糖的負調控基因。用同樣方法證實了Adh5是 β-1，3-葡聚糖正調控基因。Adh5，Csh1 和Ifd6基因編碼乙醇脫氫酶，另兩種基因Gca1和Gca2編碼葡糖淀粉酶并被證實為β-1，3-葡聚糖的正調控基因。

4.3 Fks1p

Fks1p 是 β-1，3-葡聚糖合成酶，Nett等［14］發(fā)現(xiàn)Fks1p所合成的β-1，3-葡聚糖不僅參與白念珠菌細胞壁的結構組成，同時也儲積于生物被膜內黏性基質中，使得基質像“海綿”樣隔絕藥物，阻止藥物達到潛在的靶點，保護生物被膜細胞免受藥物的干預，故被認為在生物被膜特異性的耐藥作用中至關重要。因此，以Fks1p為靶點的棘白菌素類藥物若與唑類聯(lián)用將會協(xié)同抗生物被膜。此前，該研究小組［15］觀察到，體外和體內生物被膜中的β-1，3-葡聚糖含量比懸浮菌培養(yǎng)物中所檢測到的分別升高4～10倍和10倍，因而認為這種基質葡聚糖的檢測可以作為白念珠菌生物被膜感染的一個診斷標志。

Nett等［16］不僅發(fā)現(xiàn) Fks1p 通過合成 β-1，3-葡聚糖參與了白念珠菌生物被膜對三唑類耐藥性，還進一步探討了FKS1基因表達對其他抗真菌藥敏感性的影響。結果顯示，由多西環(huán)素誘導所致的FKS1表達下降會提高生物被膜對兩性霉素B、阿尼芬凈、氟胞嘧啶的敏感性。反之，若FKS1超表達，則會增加生物被膜對阿尼芬凈和兩性霉素B的耐藥性。由此可見，由Fks1p所合成的葡聚糖通過其一定厚度的黏性屏障“隔離”藥物而成為白念珠菌生物被膜耐藥的機制之一。

4.4 SMI1

Nett等［17］等采用候選基因法探討蛋白激酶C(PKC)信號通路中相關組分在白念珠菌基質葡聚糖產生和生物被膜耐藥性方面的作用，發(fā)現(xiàn)PKC通路上游部分組分的突變株即pkc1/pkc1，bck1/bck1，mkc1/mkc1缺失突變株在基質葡聚糖產生方面與參考菌株相比無明顯差異，mkk2/mkk2突變株的葡聚糖稍低于參考菌株;該4株突變株生物被膜的耐藥性也與參考菌株基本相同。在PKC通路下游組分中，SMI1、RLM1和FKS1對于細胞壁及基質中的葡聚糖合成至關重要，實驗中觀察到smi1/smi1缺失突變株的基質葡聚糖下降4倍以上，同時對抗真菌藥物敏感性也有所提高，而互補菌株smi1/smi1+pSMI1能部分恢復對氟康唑的耐受性，表明Smi1p參與了基質葡聚糖產生及由此所致的生物被膜耐藥性。事實上，Smi1p、Rlm1p和Fks1p三種蛋白共同作用產生能“隔絕”藥物的生物被膜基質葡聚糖。

4.5 Hsp90

Robbins等［18］發(fā)現(xiàn)，分子伴侶蛋白 Hsp90對生物被膜基質有調節(jié)作用，在缺乏多西環(huán)素狀態(tài)下，Hsp90缺失突變株的葡聚糖含量為6 000 pg/mL，而以20μg/mL的多西環(huán)素抑制Hsp90轉錄后，葡聚糖含量下降至3 700 pg/mL，具有顯著性差異，但多西環(huán)素對缺乏四環(huán)素操縱子元件tetO啟動子的野生型菌株的基質葡聚糖水平不影響。考慮到另一實驗中［13］，F(xiàn)KS1/fks1突變株生物被膜基質的葡聚糖水平下降60%時該株生物被膜耐藥性消除這一關聯(lián)因素，可以推定Hsp90缺失導致了葡聚糖含量的下降，所引起約40%的葡聚糖的減少可能促成了對唑類藥物的敏感。

隨著白念珠菌基因組測序基本完成以及對其生物被膜及基質研究的繼續(xù)深入，將還會發(fā)現(xiàn)有更多的基因及表達產物參與影響生物被膜及基質的形成，以及與生物被膜基質相關耐藥性之間的關聯(lián)。

5 藥物對白念珠菌生物被膜基質的干預

既然基質是生物被膜結構的重要組分，因此如能降解基質或抑制其合成，則不失為控制生物被膜的一種有效手段，發(fā)揮作用的既有抗生素也有非抗生素類化合物。

卡泊芬凈等棘白菌素類抗真菌藥是β-1，3-葡聚糖合成酶抑制劑，Soustre等［19］觀察到，當白念珠菌生長的培養(yǎng)基中含有亞抑菌濃度(1/2MIC)的卡泊芬凈時，白念珠菌黏附到預先包被有基質蛋白的塑料的效果受到影響。結果，在受試的11株白念珠菌株(氟康唑敏感株6株，耐藥株5株)中，卡泊芬凈對所有氟康唑敏感株的黏附均減少，但對耐藥株只有60%(3株)黏附的減少。表明，卡泊芬凈對白念珠菌生物被膜發(fā)育早期的黏附有抑制作用。

同屬棘白菌素類的氨基康定(aminocandidn)也可影響白念珠菌生物被膜細胞形態(tài)與代謝。Cateau等［20］研究了亞抑菌濃度 (1/2MIC)的氨基康定對11株白念珠菌的黏附性以及基質蛋白包被對其抑菌效果的影響。結果表明，當黏附的聚苯乙烯介質表面以基質蛋白—基質凝膠 (ECM gel)包被后，氨基康定能明顯降低其中10株白念珠菌的黏附;當白念珠菌在含有氨基康定培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，6株氟康唑敏感株中有5株的黏附下降;而對于5株氟康唑耐藥株，均可觀察到對基質包被后的抑制。該實驗以及上述Soustre［19］的研究表明，氨基康定和卡泊芬凈等棘白菌素類通過影響基質而對生物被膜形成的第一步即黏附階段產生抑制作用。

Seidler等［21］在連續(xù)流動條件下構建了導管生物被膜模型并比較了兩性霉素B脂質體(LAMB)、氟康唑、卡泊芬凈對白念珠菌生物被膜的清除作用。結果，未用藥對照組的24 h生物被膜基質厚度為5～20μm，48 h基質厚度為10～150 μm。經(jīng)LAMB作用24 h能完全清除其基質 (0 μm)，而氟康唑和卡泊芬凈作用24 h后，分別保留10～25μm和10～130μm厚度的基質。從掃描電鏡和共聚焦顯微鏡下所觀察到的酵母相細胞、假菌絲及被膜基質三方面來看，0.5μg/mL的LAMB能清除生物被膜，而氟康唑和卡泊芬凈則效果較差。

衣霉素為放線菌Streptomyces lysosuperficus產生的核苷酸類抗生素，是包括酵母在內的真核細胞N-糖基化抑制劑，Pierce等［22］采用蛋白質組學和ELISA方法證實，衣霉素處理后的白念珠菌生物被膜基質蛋白糖基化發(fā)生缺陷，進而影響了生物被膜的完整性，因而亦提示N-糖基化位點可以成為抗白念珠菌生物被膜的潛在靶點。

Martins等［23］研究了DNase與抗真菌藥物聯(lián)用治療白念珠菌生物被膜的效應，通過XTT法檢測代謝及活細胞計數(shù)法證實，DNase能促進白念珠菌生物被膜細胞對抗真菌藥物尤其是兩性霉素B的敏感性，而對卡泊芬凈，盡管DNase能提高其降低線粒體活性的效應，但對活細胞計數(shù)則無影響，也不影響生物被膜對氟康唑的敏感性。表明DNase等藥通過影響生物被膜結構完整性而成為治療白念珠菌生物被膜感染的一種輔助手段。

ApoEdpL-W是源于人載脂蛋白E的一個富含色氨酸的 18氨基酸多肽，Rossignol等［24］發(fā)現(xiàn)ApoEdpL-W能抑制白念珠菌早期生物被膜，但對晚期成熟生物被膜作用較差，推測可能是ApoEdpL-W對早期生物被膜形成過程中的基質葡聚糖合成有抑制作用，但對成熟生物被膜內的葡聚糖破壞作用較弱。另外，聚氨酯、聚二甲基硅氧烷等醫(yī)學相關材料用ApoEdpL-W包被則能阻止白念珠菌生物被膜在這些材料上的形成，進一步研究發(fā)現(xiàn)其抗白念珠菌作用是依賴于液泡機制來進行的。

金格桿菌(Kingella kingae)為革蘭陰性球桿菌，Bendaoud等［25］發(fā)現(xiàn)，將該菌所培養(yǎng)的菌苔經(jīng)離心獲得的上清對包括白念珠菌、肺炎克雷伯菌甚至該菌自身在內的多種細菌和真菌生物被膜有抑制作用，經(jīng)結構分析上清中含兩種多糖:一種是與胸膜肺炎放線桿菌莢膜多糖相同的線性多糖;另一種是被稱作PAM半乳聚糖的新型線性多糖。后者通過影響生物被膜細胞、基質以及所黏附介質表面的理化性質而發(fā)揮其廣譜抗生物被膜功能，其生物學活性及潛在的應用價值有待于深入研究。

6 問題與展望

顯然，基質或EPS對于生物被膜的重要性不言而喻，可以說，無基質就無生物被膜。目前國內外對銅綠假單胞菌、葡萄球菌等細菌生物被膜基質研究相對來說要多些，而對白念珠菌生物被膜基質研究還遠遠不夠。由于基質不僅涉及生物被膜結構組成，還具有分解酶活性，更重要的是參與了耐藥性形成，基質所致耐藥性不僅與造成抗菌藥物的機械“隔絕”有關，同時還受到多種相關基因表達的調控。鑒于基質在生物被膜形成中的作用，目前已經(jīng)開始針對基質來設計或篩選破壞生物被膜即以基質為靶點的藥物;筆者實驗室近期篩選出某些中藥有效成分具有抑制生物被膜基質的功效。另外，因為基質是生物被膜的主要組分，故有人建議基質還可作為生物被膜感染診斷的相對特異性標志，當然這種診斷如能成立則會涉及到基質的分離提取(確保相關組分如eDNA等來自生物被膜基質而避免污染有菌細胞裂解釋放的成分)、定性定量等多個環(huán)節(jié)，需不斷完善才可成為“生物被膜感染”的診斷依據(jù)。相信通過對基質不斷深入的研究，不僅豐富了生物被膜的基礎理論，同時對于生物被膜相關疾病的診斷與防治也具有積極的臨床價值。

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