楊清媛 張相年 趙樹進(jìn) (廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院藥學(xué)部，廣東 廣州 5000)

超氧化物歧化酶(SOD)是生物體內(nèi)重要的自由基清除劑，主要催化超氧陰離子(O·-2)的歧化反應(yīng)，能緩解許多由自由基介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，減輕組織缺血性損傷，預(yù)防和治療輻射損傷。在臨床上SOD主要用于延緩人體衰老，防止色素沉著，消除局部炎癥，特別是治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、慢性多發(fā)性關(guān)節(jié)炎及輻射防護(hù)。但半衰期短、穩(wěn)定性差、免疫原性等因素限制了SOD的臨床應(yīng)用。為解決這些問題，國內(nèi)外用化學(xué)修飾、基因重組和SOD修飾物等改造方法來延長半衰期、增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性、降低酶的免疫原性，目前對SOD進(jìn)行化學(xué)修飾是研究的熱點(diǎn)，且取得了很大的進(jìn)展。國內(nèi)外有用脂肪酸、多糖類物質(zhì)、月桂酰氯、右旋糖酐、聚乙二醇(PEG)等〔1，2〕作為修飾劑的報(bào)道，而以 PEG及其衍生物對SOD的修飾較為有效。本文著重對PEG的修飾原理、修飾物種類及修飾后產(chǎn)物的分析方法進(jìn)行綜述。

1 PEG修飾原理

PEG由環(huán)氧乙烷聚合而成，最簡單的結(jié)構(gòu)是一種直鏈的以羥基結(jié)尾的聚醚，其分子式為 HO-(CH2CH2O)-CH2CH2-OH。直接用PEG修飾時(shí)易發(fā)生交聯(lián)和團(tuán)聚現(xiàn)象，故單甲氧基PEG(mPEG)應(yīng)用較多，其分子式為CH3O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH，即將PEG一端的活性羥基用甲氧基封閉，以減少或避免交聯(lián)或團(tuán)聚現(xiàn)象，是一種水溶性聚合物。PEG與蛋白的非必需基團(tuán)結(jié)合后，分子表面形成一個(gè)PEG保護(hù)層，使得底物與酶的接觸受到一定的空間阻隔，可作為一種屏障擋住蛋白分子表面的抗原決定簇，避免抗體的產(chǎn)生或者阻止抗原和抗體的結(jié)合而抑制免疫反應(yīng)的產(chǎn)生，酶活性因而下降。同時(shí)，正是由于這種保護(hù)層的形成保護(hù)了該酶免受體內(nèi)水解酶的消化，表現(xiàn)了較強(qiáng)的抗酶水解能力。蛋白經(jīng)PEG修飾后分子量增加，分子的體積增大，腎小球過濾減少，PEG的屏障作用保護(hù)了蛋白不易被蛋白酶降解，同時(shí)減少了抗體的產(chǎn)生，PEG的修飾使蛋白大分子可以避免被腎臟很快地排除，因而其血漿存留時(shí)間得到顯著延長，這些均有助于蛋白藥物循環(huán)半衰期的延長。同時(shí)，PEG修飾會使蛋白活性降低，這種影響大小與修飾劑、修飾條件和蛋白本身的特點(diǎn)相關(guān)〔3～5〕。

1.2 修飾劑種類和修飾途徑〔6，7〕對于修飾反應(yīng)的特異性，mPEG修飾劑的發(fā)展經(jīng)歷了第一代和第二代。第一代小Mr(＜20 000)PEG修飾為非定點(diǎn)修飾，mPEG交聯(lián)的基團(tuán)是賴氨酸的α-氨基和ε-氨基，交聯(lián)度不均一，沒有特異性，PEG修飾后的蛋白產(chǎn)物是混合物，使修飾蛋白的分離純化和鑒定很困難，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。第二代高M(jìn)r(＞20 000)PEG修飾則向定點(diǎn)修飾(特異性修飾)方向發(fā)展。第二代mPEG修飾中，分為賴氨酸ε-氨基定點(diǎn)修飾、N末端定點(diǎn)修飾等。

表1 修飾SOD常用的mPEG修飾劑

以下簡單介紹幾種修飾的合成路線:

(1)氰脲酰氯法 -CC mPEG是由mPEG和CC在絕對無水條件下制備而成，易與蛋白上氨基發(fā)生反應(yīng)，為最經(jīng)典的耦聯(lián)方法。該方法得到的修飾SOD氨基修飾率達(dá)到80%，酶活力保持75%，且可以降低酶的免疫原性，同時(shí)增加了對蛋白水解酶的抵抗能力，提高在體內(nèi)的半衰期。缺點(diǎn)是易水解，修飾選擇性不高，修飾產(chǎn)物不均一，且這種合成方法引入有毒的三氯均三嗪，從而其修飾產(chǎn)物只能用于工業(yè)化生產(chǎn)，限制了在其他領(lǐng)域的應(yīng)用。

(2)1，1'-羥基二咪唑法〔8〕該種方法是通過mPEG上的-OH基團(tuán)與1，1'-羥基二咪唑法發(fā)生酯化反應(yīng)，再與SOD反應(yīng)制得。此法設(shè)備簡單，反應(yīng)條件溫和，耦聯(lián)物穩(wěn)定，可以使酶活力保持95%以上，但耦聯(lián)反應(yīng)慢，反應(yīng)時(shí)間太長，修飾產(chǎn)物易酶解，另外原料也不易獲得，所以應(yīng)用時(shí)有一定的困難。

(3)N-羥基琥珀酰亞胺法 SS-mPEG已被廣泛使用多年，其修飾SOD上賴氨酸殘基的氨基。該法可以使酶活力保持90%以上，且修飾產(chǎn)物比較均一，但反應(yīng)步驟太長，操作繁瑣，應(yīng)用頗為不便。

(4)mPEG 還原烷基化反應(yīng)〔9，10〕mPEG-醛是一種新型PEG修飾劑，與蛋白上賴氨酸殘基的α-氨基或N末端-氨基通過曼尼希反應(yīng)形成Schiff堿，經(jīng)過氰基硼氫化鈉(NaCNBH3)還原形成比較穩(wěn)定的亞胺連接體，該法連接鍵相對穩(wěn)定，反應(yīng)選擇性高，常見的多態(tài)性大為減低。

2 檢測方法

目前，對修飾后SOD進(jìn)行分析的方法主要有分光光度法、色譜、電泳、紅外光譜、核磁共振、質(zhì)譜等〔11〕。

2.1 肽圖譜〔12〕肽圖譜是蛋白質(zhì)經(jīng)水解后測定肽段以獲得相關(guān)的信息，是生物制品高特異的鑒定方法。目前主要有液相肽圖和質(zhì)譜肽圖。

2.1.1 液相肽圖 雙向電泳、等電聚焦電泳等凝膠電泳技術(shù)在蛋白質(zhì)多肽的純度、雜質(zhì)檢查以及分子量、等電點(diǎn)、含量測定等方面發(fā)揮了重要作用。對于分子量大于10 kU的蛋白質(zhì)，凝膠電泳技術(shù)已日臻完善;而對于分子量小于10 kU的小分子多肽分析總是不盡如人意。

Nadithe等〔13〕使用分子尺寸排阻色譜(Size Exclusive Chromatography，SEC)分離了 PEG修飾的血紅蛋白-抗氧化酶組(Hb-SOD-CAT)，測定了PEG-Hb-SOD-CAT各分離峰的280 nm紫外吸收值和平均分子量。

高效毛細(xì)管電泳(HPCE)是近十幾年發(fā)展起來的一項(xiàng)新的分析技術(shù)，它將電泳技術(shù)和色譜技術(shù)結(jié)合，以高壓電場為驅(qū)動(dòng)力，毛細(xì)管為分離通道，依樣品中被測組分之間電泳淌度和分配系數(shù)的不同而達(dá)到分離目的。具有分離效率高，速度快、模式多等特點(diǎn)。Bullock等〔14〕使用毛細(xì)管電泳法檢測了PEG5000-SOD的修飾度分布，分離了耦聯(lián)有1～8個(gè)PEG鏈的不同的SOD蛋白，并對其進(jìn)行了定量分析，其結(jié)果與MALDI質(zhì)譜分析結(jié)果基本一致。

2.1.2 質(zhì)譜肽圖〔15〕質(zhì)譜(MS)具高靈敏性和快速性，特別適合分析多肽類物質(zhì)。目前應(yīng)用較多的有連續(xù)流快原子轟擊質(zhì)譜法，電噴霧離子化質(zhì)譜法和基質(zhì)輔助激光解吸質(zhì)譜法?；|(zhì)輔助激光解吸質(zhì)譜法(MALDI-MS)特別適合混合蛋白質(zhì)多肽類物質(zhì)相對分子量的精確測定，其最大優(yōu)點(diǎn)是允許樣品中含有幾百毫摩爾的緩沖液及表面活性劑，且靈敏度比別的離子化方式高。Chowdhury等〔16〕采用MALDI-MS法分析了PEG修飾的SOD，發(fā)現(xiàn)SOD是一種非共價(jià)結(jié)合的二聚體，每個(gè)SOD單體包含了10個(gè)賴氨酸，是連接PEG的位點(diǎn)，有0～7個(gè)不等數(shù)目的PEG分子耦聯(lián)到了牛血清SOD上。

2.2 核磁共振(NMR) 該法廣泛用于解析化學(xué)物質(zhì)結(jié)構(gòu)和反應(yīng)性能，已發(fā)展為分子生物學(xué)的重要實(shí)驗(yàn)技術(shù)。NMR主要用于核定多肽的微觀理化性質(zhì)，可以檢測一些不能用X-射線晶體衍射分析方法檢測的多肽。

Banci等〔17〕研究了鈷鹽取代的PEG-SOD的1H-NMR氫譜，結(jié)果可知進(jìn)行PEG表面化學(xué)修飾后的酶活降低并不是因?yàn)閿_亂了活性位點(diǎn)的幾何結(jié)構(gòu)，而是由往酶活性位點(diǎn)運(yùn)輸O-2離子的通道減少所導(dǎo)致。

3 生物活性測定

SOD被PEG修飾后在臨床應(yīng)用中顯示出優(yōu)良性質(zhì)。研究表明經(jīng)過化學(xué)修飾后的SOD基本上保持了天然酶的活性，在耐熱、耐酸堿和抗胃蛋白酶分解等方面均有很大提高〔18〕。SOD的活性測定方法多為間接法。

3.1 物理法 基本原理為根據(jù)O－2的物理性質(zhì)測定O－2的歧化量，從而確定SOD的活力。已知的方法有脈沖輻射分解法、NMR和電子順磁波譜法。所需的儀器昂貴，較少應(yīng)用。

3.2 一般化學(xué)法

3.2.1 細(xì)胞色素C還原法 國外多采用，但該法靈敏度較低，易受反應(yīng)底物不純的影響。

3.2.2 鄰苯三酚法〔19，20〕鄰苯三酚在pH8.3的緩沖液中發(fā)生自氧化反應(yīng)，產(chǎn)生O－2。其自氧化率受到SOD的抑制。這種方法具有操作簡便，試劑簡單等優(yōu)點(diǎn)。但是該法的顯色反應(yīng)與光吸收值(A420)測定必須同步進(jìn)行，且不能同時(shí)處理多個(gè)樣品?，F(xiàn)多采用改進(jìn)后的鄰苯三酚自氧化法。

3.3 電泳法 將待測樣品與標(biāo)準(zhǔn)品SOD進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳后，可直接進(jìn)行SOD蛋白譜帶染色，SOD酶活性正染色，或是SOD酶活性負(fù)染色。由于SOD正染和負(fù)染的靈敏度較高，0.1個(gè)酶活性單位的SOD在凝膠上即可顯示出可目測的SOD活性譜帶，因此可配成一系列SOD濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)樣品，同待測樣品一起電泳，通過對SOD譜帶進(jìn)行線形掃描，便可準(zhǔn)確測出樣品中的SOD活性。該法不及化學(xué)法簡便，但鑒定SOD時(shí)，卻較化學(xué)法為優(yōu)。

此外，還有氯化硝基四唑氮藍(lán)(NBT)還原法〔21〕、沒食子酸法、亞硫酸鹽法、6-羥多巴胺法、NBT光還原法、光還原法、電還原法和免疫學(xué)法等等。

4 結(jié)語

對于改善SOD的臨床作用時(shí)間和療效，PEG修飾技術(shù)已被公認(rèn)為最為有效的方法之一。但現(xiàn)今對SOD的PEG修飾多采用常規(guī)的多點(diǎn)修飾，不能得到理想的修飾效果。而且多點(diǎn)隨機(jī)修飾反應(yīng)后的產(chǎn)物是一混合物，呈現(xiàn)出的多態(tài)性給PEG修飾的SOD分析帶來較大困難。因此隨著PEG修飾蛋白技術(shù)研究的不斷深入，定點(diǎn)單修飾得到了不斷發(fā)展。這對于SOD未來的應(yīng)用前景有著重要的意義。

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