楊華山 王金國 蔣莉莉 (鄭州大學(xué)護理學(xué)院，河南 鄭州 450052)

由于阿爾茨海默病(AD)患者腦內(nèi)環(huán)境的改變，淀粉樣β蛋白(Aβ)的沉積阻礙了內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖及分化為成熟的神經(jīng)元，使退變或損傷的神經(jīng)元得不到足夠的修復(fù)〔1，2〕。胰島素樣生長因子(IGF-1)可調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞的生長、發(fā)育和分化。Mustafa等〔3〕發(fā)現(xiàn)家族性AD成員的IGF-1水平明顯低于其家族中的健康成員。Rivera等〔4〕報道，AD患者的大腦組織中IGF-1及其受體的表達(dá)明顯比對照組低，IGF-1受體陽性的細(xì)胞明顯減少，且和疾病的嚴(yán)重程度有明顯的相關(guān)性。在本室的前期研究中，構(gòu)建了IGF-1基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，并轉(zhuǎn)染了神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)，發(fā)現(xiàn)在被pLXSN-IGF-1病毒轉(zhuǎn)染過的NSCs中IGF-1基因有較高的表達(dá)〔5〕。本實驗將IGF-1基因修飾的NSCs植入AD模型大鼠的側(cè)腦室，觀察其對AD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶的改善效果，并檢測IGF-1在動物體內(nèi)的表達(dá)情況，旨在為NSCs移植和基因治療AD提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及分組 健康雄性SD大鼠(3～4月齡，體重260～320 g)，由鄭州大學(xué)實驗動物中心提供。取成功AD模型大鼠24只，分為AD模型組、NSCs組、IGF-1修飾的神經(jīng)干細(xì)胞移植組(IGF-1/NSCs組)，另設(shè)正常對照組，每組8只。

1.1.2 主要試劑和儀器 IGF-1抗體均購自武漢博士德公司。Y型電迷宮(張家港生物醫(yī)學(xué)儀器廠)、熒光顯微鏡(日本尼康E600)、大鼠立體定向儀 SN-2型(日本東京成茂科學(xué)器械研究所)。

1.2 方法

1.2.1 AD 模型制備 Aβ1～40溶于無菌生理鹽水(2 μg/μl)，用前37℃孵育1 w以上，使其變?yōu)榫奂癄顟B(tài)。除正常對照組以外的三組大鼠經(jīng)10%水合氯醛腹腔麻醉(3 ml/kg)，參照Paxinos大鼠圖譜，選取雙側(cè)海馬CA1區(qū)為注射靶區(qū)，具體部位見參考文獻(xiàn)〔1〕。

1.2.2 腦內(nèi)移植IGF-1基因修飾神經(jīng)干細(xì)胞 造模8～10 d行腦細(xì)胞移植。移植前1 d，加入培養(yǎng)的NSC和IGF-1修飾的NSC 5 h，漂洗2遍后再用新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)16 h，收集并計數(shù)培養(yǎng)的NSC和IGF-1-NSC。利用大鼠立體腦定位儀進(jìn)行腦室內(nèi)移植，分別吸取 NSC和 IGF-1-NSC細(xì)胞懸液各5 μl(約3×105)，按選定的側(cè)腦室坐標(biāo)進(jìn)針(AP:0.6 mm、L:1.5 mm、V:4 mm)，注射速度為 0.5 μl/mm，留針 10 min。

AD模型組則以相同的方法、同樣的位點注入等量無菌生理鹽水。正常對照組不施以任何處理。移植4 w后進(jìn)行行為學(xué)檢測和病理學(xué)觀察。

1.2.3 AD大鼠行為學(xué)檢測 采用Y型電迷宮:①學(xué)習(xí)能力測試:以大鼠受電擊后從起步區(qū)直接逃至安全區(qū)為正確反應(yīng)，以連續(xù)10次中有9次(9/10)正確反應(yīng)前所需的電擊次數(shù)(即嘗試次數(shù))表示其學(xué)習(xí)獲得能力。②記憶再現(xiàn)測試:上述達(dá)標(biāo)大鼠休息24 h后，同法檢測其記憶力。以達(dá)9/10標(biāo)準(zhǔn)前的嘗試次數(shù)表示記憶再現(xiàn)能力。

1.2.4 免疫組織化學(xué)染色 迷宮試驗結(jié)束后各組大鼠經(jīng)10%水合氯醛腹腔麻醉(3 ml/kg)后，經(jīng)主動脈相繼灌注生理鹽水100 ml、40 g/L多聚甲醛(4℃)350 ml?？焖偃∧X，固定后于移植點附近做層厚10 μm冰凍切片，IGF-1一抗:兔抗IGF-1抗體，二抗:羊抗兔IgG。DAB顯色5 min，蘇木素復(fù)染2 min，染色后進(jìn)行脫水、透明、封片。以PBS作為陰性對照。

1.2.5 移植后AD大鼠腦內(nèi)病理改變 迷宮試驗結(jié)束后各組大鼠經(jīng)4%多聚甲醛灌注取腦，進(jìn)行病理學(xué)觀察。

2 結(jié)果

2.1 AD模型建立 模型組海馬區(qū)椎體細(xì)胞明顯減少，同時可見許多細(xì)胞體積縮小，胞核固縮，染色加深。細(xì)胞形態(tài)與正常海馬神經(jīng)元不同。顯示模型建立成功。

2.2 不同實驗組AD模型大鼠的行為學(xué)變化 與正常對照組比較，模型組大鼠空間學(xué)習(xí)能力、記憶能力均顯著下降(P＜0.05，P＜0.01)。兩個細(xì)胞移植組空間學(xué)習(xí)能力、記憶能力均顯著高于模型對照組(P＜0.05，P＜0.01)，基本達(dá)到正常水平(P＞0.05)。見表1。

表1 各組大鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能力的比較()

表1 各組大鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能力的比較()

與模型組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01

學(xué)習(xí)時間 正確記憶時間正常對照組 8 57.12±5.282) 8.50±0.672)組別 n AD模型組 8 98.62±7.69 3.80±0.55 NSCs組 8 72.47±6.371) 6.70±0.471)IGF-1/NSCs組 8 66.43±6.852) 7.50±0.592)

2.3 免疫組織化學(xué)染色 移植4 w后，IGF-1修飾的神經(jīng)干細(xì)胞移植組大鼠在海馬可見較多的IGF-1陽性細(xì)胞，主要分布在海馬CA1、CA3區(qū)多形層和分子層及齒狀回，呈點狀沿多形層和分子層長軸分布，AD模型組大鼠海馬CA1區(qū)多形層和分子層染色較正常組淺。見圖1。

圖1 各組免疫組織化學(xué)染色結(jié)果(×100)

2.4 移植后各實驗組AD大鼠模型腦內(nèi)病理改變 光鏡下觀察各組大鼠不同腦區(qū)病理形態(tài)學(xué)變化，常規(guī)HE染色正常對照組海馬結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞排列整齊，形態(tài)正常，分布均勻。NESs組和IGF-1/NSCs組海馬可見少量膠質(zhì)細(xì)胞增生，損傷的神經(jīng)元開始修復(fù);尤其以IGF-1/NSCs組明顯，多數(shù)受損的神經(jīng)組織得到修復(fù)接近于正常，少見細(xì)胞凋亡改變。模型組海馬椎體細(xì)胞帶紊亂、變稀、中斷，同時可見許多細(xì)胞體積縮小，胞核固縮，染色加深。見圖2。

圖2 各組AD大鼠腦區(qū)病理改變(×100)

3 討論

NSCs的發(fā)現(xiàn)使人們對神經(jīng)系統(tǒng)再生機制和神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療均有了新的認(rèn)識。NSCs因為具有強大的自我復(fù)制及產(chǎn)生多種不同類型子細(xì)胞的能力，使其成為良好的供者來源。IGF-1是一種多功能細(xì)胞增殖調(diào)控因子，其功能行使主要靠與IGF-1受體結(jié)合來完成。IGF-1受體在胚胎及成年大腦中廣泛存在，表明它與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的生長發(fā)育關(guān)系密切。在老年動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，尤其是海馬結(jié)構(gòu)中IGF-1表達(dá)呈年齡相關(guān)性下降，而IGF-1有著類似于神經(jīng)生長因子的促進(jìn)神經(jīng)突觸形成和維持神經(jīng)細(xì)胞功能的作用，可改善老齡動物的記憶，學(xué)習(xí)能力〔10〕。有研究表明外源性IGF-1通過催化乙酰膽堿的形成，保護膽堿能神經(jīng)元，從而改善腦功能，提示IGF-1在以智能喪失和行為異常為主要表現(xiàn)的老年性癡呆的治療中可能具有一定的臨床意義。

本實驗結(jié)果表明:大鼠海馬CA1區(qū)注射Aβ后，大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力明顯下降，NSCs和IGF-1基因修飾后的NSCs移植后，AD模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力有不同程度的改善，其中NSCs組兩項指標(biāo)與模型組大鼠比較有統(tǒng)計學(xué)差異，顯示移植NSCs對AD模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶力有一定的改善作用，這可能與NSCs分泌某些神經(jīng)營養(yǎng)因子或增加腦細(xì)胞有關(guān)。IGF-1/NSCs組兩項指標(biāo)差異最為明顯，都接近于正常組大鼠，它對基底前腦膽堿能神經(jīng)元的保護作用也最強，這與移植細(xì)胞分泌有活性的IGF-1，促進(jìn)海馬膽堿能系的存活和修復(fù)有關(guān)。

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2 Haughey NJ，Nath A，Chan SL，et al.Disruption of neurogenesis by amyloid-peptide，and perturbed neural progenitor cell homeostasis，inmodels of Alzheimer disease〔J〕.J Neurochem，2002;83(6):1509-24.

3 Mustafa A，Launfelt L.Decreased plasma insulin-like growth factor-1 level in familial Alzheimer disease patients carrying the Swedish APP 670/671 mutation〔J〕.Dement Geriatr Cogn Disord，1999;10(6):446-51.

4 Rivera EJ，Goldin A，F(xiàn)ulmer N，et al.Insulin and insulin-like growth factor expression and function deteriorate with progression of Alzheimer disease:link to brain reductions in acetylcholine〔J〕.J Alzheimers Dis，2005;8(3):247-68.

5 王 進(jìn)，崔景彬，張亞卓，等.胰島素樣生長因子-1基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建〔J〕.解剖學(xué)報，2006;37(2):187-9.

6 Snnag WE，Lynch C，Thomton P，et al.The effects of growth hormone and IGF-1 defficency on cerebrobascular and brain ageing〔J〕.J Anat，2000;197(4):575-85.