閔鶴鳴 黃 澈 魯璐清 姜興千 王文娟 武曉寧 羅玉敏 閔連秋

(遼寧醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院，遼寧 錦州 121001)

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是一種不同于經(jīng)典凋亡途徑的新的細(xì)胞凋亡途徑〔1〕，它所引發(fā)的細(xì)胞凋亡是通過下游的調(diào)控信號(hào)分子產(chǎn)生的，其中一個(gè)重要的途徑就是ERS介導(dǎo)的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-12(Caspases-12)途徑〔2〕。研究表明Caspases-12與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的聯(lián)系非常顯著，且只有在ERS引發(fā)的細(xì)胞凋亡中起作用〔3〕。小牛血清去蛋白注射液(DCSI)的主要藥理活性成分為磷酸肌醇寡糖(IPOs)和小分子激活肽〔4〕，對(duì)腦缺血再灌注損傷有一定的保護(hù)作用〔5，6〕，但其具體機(jī)制還不十分清楚。本實(shí)驗(yàn)擬探討DCSI是否通過阻斷ERS引發(fā)的細(xì)胞凋亡途徑對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠產(chǎn)生保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與試劑 健康Sprague-Dawley(SD)大鼠，雌雄各半，共130只，體重(300±20)g，由遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào):SCXK(遼)2003-0007。DCSI購自錦州奧鴻藥業(yè)有限責(zé)任公司(商品名:奧德金;批號(hào):20080810);Caspase-12兔抗大鼠抗體由北京博奧森生物有限公司提供;RT-PCR試劑盒由大連寶生物公司提供。

1.2 方法

1.2.1 分組與給藥 健康SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(10只)、模型組(60只)和DCSI組(60只)，每籠6只。DCSI組按照每日80 mg/kg的劑量于術(shù)前1 w開始經(jīng)大鼠尾靜脈注射給藥，1次/d，末次給藥時(shí)間在術(shù)前5 h;模型組和假手術(shù)組給予相同體積的生理鹽水，療程和給藥方法與DCSI組相同。分別在腦缺血再灌注后3、6、12、24、48 h五個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行神經(jīng)缺損功能評(píng)分，然后處死大鼠，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 動(dòng)物模型的建立 參照Longa等〔7〕方法加以改進(jìn)制備大鼠大腦中動(dòng)脈(MCA)局灶性腦缺血再灌注模型。模型成功的標(biāo)準(zhǔn)為大鼠清醒后出現(xiàn)左側(cè)Horner征及對(duì)側(cè)以前肢為主的癱瘓，神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分1～3分〔4〕。假手術(shù)組僅暴露頸總動(dòng)脈(CCA)、頸外動(dòng)脈(ECA)及頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)，栓線插入CCA及ICA但不阻斷MCA。采用Longa等〔7〕6級(jí)5分制評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)估。

1.2.3 腦組織病理學(xué)觀察 切片常規(guī)脫蠟水化，焦油紫染色。正常細(xì)胞不同程度的含有尼氏體，經(jīng)焦油紫染色后呈藍(lán)色，細(xì)胞凋亡后，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)尼氏體可發(fā)生變化，甚至可以消失。

1.2.4 TUNEL檢測大鼠海馬細(xì)胞凋亡情況 切片常規(guī)脫蠟水化，3%H2O2室溫處理后蛋白酶K 37℃消化10 min。標(biāo)記液32℃標(biāo)記2 h，后封閉30 min，生物素化地高辛抗體37℃反應(yīng)37 min。加鏈霉親和素-生物素復(fù)合物(SABC)、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色。常規(guī)封片，鏡下觀察，在海馬CA1區(qū)和假手術(shù)組相應(yīng)區(qū)域不重復(fù)隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野，計(jì)算陽性細(xì)胞百分比(陽性細(xì)胞數(shù)/計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)×100%)。

1.2.5 免疫組化檢測大鼠海馬Caspase-12抗原的表達(dá) 石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟、復(fù)水，按照免疫組化試劑盒說明進(jìn)行常規(guī)SABC法，陰性對(duì)照采用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗。顯微鏡下觀察大腦海馬CA1區(qū)Caspase-12表達(dá)情況，染色陽性反應(yīng)物為棕黃色顆粒。每只大鼠取1張腦組織切片，顯微鏡下定位，取缺血側(cè)大腦海馬CA1區(qū)觀察，每張免疫組化切片中采集5個(gè)具有代表性的高倍視野，根據(jù)光鏡400倍時(shí)陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)，采用雙盲法計(jì)算每個(gè)高倍鏡視野Caspase-12陽性細(xì)胞數(shù)。

1.2.6 Western印跡檢測大鼠海馬Caspase-12蛋白的表達(dá)用10%的水合氯醛按350 mg/kg劑量腹腔注射麻醉動(dòng)物，斷頭取腦。參照Ishige等〔8〕方法進(jìn)行勻漿，上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗、二抗孵育，洗膜后進(jìn)行增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)反應(yīng)，暗室曝光，顯影后沖洗膠片。凝膠成像分析系統(tǒng)攝像分析測定目標(biāo)帶(IDV)，計(jì)算出各組目標(biāo)帶與β-actin的比值。

1.2.7 RT-PCR檢測大鼠海馬Caspase-12 mRNA的表達(dá) 取凍存的腦組織置于離心管中，Trizol法抽提RNA。參照Bian等〔9〕方法構(gòu)建反應(yīng)體系。Caspase-12和β-actin基因全長檢索自Pubmed GenBank，引物由南京金思特科技有限公司設(shè)計(jì)。Caspase-12上游引物:5'-CCTGGAAGGAATCTGTGG-3'，下游引物5'-AGTTCACCTGGGACCTCA-3'，預(yù)擴(kuò)增片段438 bp。

β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)上游引物:5'-CCTAAGGCCAACCGTGAA-3'，下游引物:5'-AGCCAGGGCAGTAATCTC-3'，預(yù)擴(kuò)增片段為630 bp。經(jīng)30個(gè)循環(huán)后，取20 μl反應(yīng)產(chǎn)物，加2 μl 10倍上樣緩沖液，1%瓊脂糖凝膠電泳，成像，測目的基因和β-actin的表達(dá)強(qiáng)度，以同一標(biāo)本的β-actin產(chǎn)物強(qiáng)度值校正各目的基因的強(qiáng)度值，相對(duì)值=目的基因表達(dá)強(qiáng)度/β-actin表達(dá)強(qiáng)度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件中的單因素方差分析，數(shù)據(jù)以的形式表示，組間差異比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 DCSI對(duì)腦缺血再灌注后大鼠神經(jīng)行為的影響 模型組和DCSI組大鼠清醒后出現(xiàn)不同程度的左側(cè)Horner征及對(duì)側(cè)以前肢為主的癱瘓，5個(gè)時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分在1～3分，造模成功。假手術(shù)組神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分為0。與模型組比較，DCSI組各時(shí)間點(diǎn)癥狀相似，神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分相對(duì)較低，但無顯著性差異(P＞0.05)。見表1。

表1 各組大鼠腦缺血再灌注后各時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分(分，)

表1 各組大鼠腦缺血再灌注后各時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分(分，)

組別 模型組 DCSI組3 h 2.50±0.58 2.20±0.45 6 h 2.40±0.55 2.00±0.63 12 h 2.50±0.58 2.25±0.50 24 h 2.67±0.58 2.25±0.96 48 h 2.40±0.89 2.25±0.50

2.2 DCSI對(duì)腦缺血再灌注后大鼠腦組織病理變化的影響大鼠海馬CA1區(qū)腦組織病理學(xué)尼氏染色光學(xué)顯微鏡(×400)下觀察。假手術(shù)組尼氏體清晰可辨，受染后呈塊狀，尼氏體大而數(shù)量多，反映神經(jīng)元合成蛋白質(zhì)的功能較強(qiáng);模型組尼氏體減少甚至消失，表現(xiàn)為尼氏體從核周開始崩解為細(xì)塵狀顆粒，并逐漸向外擴(kuò)展，進(jìn)而完全溶解消失，胞質(zhì)著色淺，胞體腫脹，細(xì)胞由多極形變?yōu)閳A形，胞核移位;DCSI組與假手術(shù)組比較各時(shí)間點(diǎn)有不同程度的尼氏體減少，但與模型組相比，神經(jīng)元細(xì)胞中尼氏體明顯增加，神經(jīng)元細(xì)胞的損害相對(duì)較輕。見圖1。

2.3 DCSI對(duì)腦缺血再灌注后大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響 假手術(shù)組海馬CA1區(qū)偶見細(xì)胞凋亡，推測是生理性死亡。腦缺血再灌注后模型組和DCSI組均可見神經(jīng)細(xì)胞凋亡，除缺血再灌注3、6 h后凋亡細(xì)胞數(shù)無明顯差異外，缺血再灌注12、24、48 h時(shí)DCSI組的凋亡細(xì)胞數(shù)均少于模型組(P＜0.05，P＜0.01)。見表2。

表2 三組大鼠腦缺血再灌注后神經(jīng)細(xì)胞凋亡的變化(%，)

表2 三組大鼠腦缺血再灌注后神經(jīng)細(xì)胞凋亡的變化(%，)

P1值:模型組與假手術(shù)組比較;P2值:DCSI組與模型組比較;下表同

組別 假手術(shù)組 模型組 P1值 DCSI組 P2值3 h 2.21±0.71 9.03±2.38 0.012 7.29±2.06 0.519 6 h － 19.85±2.01 0.000 17.95±3.75 0.435 12 h － 28.67±4.01 0.000 21.79±5.03 0.019 24 h － 54.50±3.71 0.000 44.42±4.75 0.002 48 h － 48.19±6.59 0.000 35.09±5.87 0.000

2.4 免疫組化檢測大鼠腦缺血再灌注后Caspase-12抗原的表達(dá) Caspase-12抗原陽性細(xì)胞呈棕黃色，細(xì)胞皺縮、變形，胞質(zhì)胞核均有表達(dá)，但以胞核表達(dá)為主，多數(shù)細(xì)胞發(fā)生壞死的形態(tài)學(xué)改變，可見核固縮、核溶解。與假手術(shù)組相比，模型組和DCSI組Caspase-12抗原表達(dá)均明顯增高(P＜0.01);與模型組相比，除3 h、48 h兩組差異不明顯外，DCSI組其余各時(shí)間點(diǎn)Caspase-12抗原表達(dá)均明顯低于模型組(P＜0.01，P＜0.05)。見表3。

表3 三組大鼠海馬Caspase-12抗原的表達(dá)()

表3 三組大鼠海馬Caspase-12抗原的表達(dá)()

組別 假手術(shù)組 模型組 P1值 DCSI組 P2值3 h 4.00±0.89 8.00±0.82 0.060 8.00±1.41 1.000 6 h － 27.40±4.28 0.000 22.33±3.14 0.013 12 h － 67.25±3.78 0.000 44.50±3.70 0.000 24 h － 86.33±3.51 0.000 72.50±5.69 0.000 48 h － 14.20±3.42 0.000 10.25±1.89 0.073

2.5 Western印跡方法檢測各組大鼠海馬Caspase-12蛋白的表達(dá) Caspase-12蛋白在假手術(shù)組表達(dá)很少，缺血再灌注后各時(shí)間點(diǎn)表達(dá)逐漸增加，至24 h時(shí)達(dá)到高峰，然后逐漸下降，與假手術(shù)組相比，模型組和DCSI組表達(dá)均明顯增加(P＜0.01)。與模型組相比，DCSI組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)Caspase-12蛋白表達(dá)相對(duì)較少(P＜0.01)。見表4，圖2。

2.6 RT-PCR檢測大鼠腦缺血再灌注后Caspase-12 mRNA的表達(dá) Caspase-12 mRNA在假手術(shù)組表達(dá)很少，缺血再灌注后隨時(shí)間的延長表達(dá)逐漸增加，至24 h達(dá)到高峰后逐漸下降，與假手術(shù)組相比，模型組和DCSI組表達(dá)均明顯增高(P＜0.01);與模型組比較，DCSI組在除3 h外的各時(shí)間點(diǎn)Caspase-12表達(dá)均顯著降低(P＜0.01)。見表5，圖3。

圖1 DCSI對(duì)大鼠腦缺血再灌注后海馬CA1區(qū)腦組織病理變化的影響(尼氏染色，×400)

表4 三組大鼠海馬Caspase-12蛋白的表達(dá)(，×103)

表4 三組大鼠海馬Caspase-12蛋白的表達(dá)(，×103)

組別 假手術(shù)組 模型組 P1值 DCSI組 P2值7 0.000 6 h － 172.30±2.18 0.000 162.73±0.84 0.000 12 h － 184.10±0.78 0.000 175.76±1.27 0.000 24 h － 212.70±1.42 0.000 205.76±0.43 0.000 3 h 144.21±1.67 160.14±1.74 0.000 151.17±0.9 48 h － 192.62±0.68 0.000 178.80±1.76 0.000

圖2 DCSI對(duì)大鼠腦缺血再灌注后海馬CA1區(qū)Caspase-12蛋白表達(dá)的影響(Western印跡法)

表5 DCSI對(duì)腦缺血再灌注后Caspase-12 mRNA表達(dá)的影響()

表5 DCSI對(duì)腦缺血再灌注后Caspase-12 mRNA表達(dá)的影響()

組別 假手術(shù)組 模型組 P1值 DCSI組 P2值3 h 0.63±0.01 0.71±0.02 0.000 0.69±0.03 0.260 6 h － 0.78±0.04 0.000 0.73±0.01 0.001 12 h － 0.87±0.02 0.000 0.81±0.01 0.000 24 h － 0.95±0.01 0.000 0.86±0.02 0.000 48 h － 0.83±0.01 0.000 0.78±0.02 0.007

圖3 DCSI對(duì)大鼠腦缺血再灌注后海馬CA1區(qū)Caspase-12 mRNA表達(dá)的影響(RT-PCR)

3 討論

缺血期間，特別是再灌注時(shí)，自由基的產(chǎn)生與內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)失衡，會(huì)引起腦組織損傷。本研究參照Longa等〔7〕方法加以改進(jìn)制備大鼠MCA局灶性腦缺血再灌注模型。大鼠清醒后出現(xiàn)左側(cè)Horner征及對(duì)側(cè)以前肢為主的癱瘓，5個(gè)時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分在1～3分，模型成功。細(xì)胞和分子學(xué)水平結(jié)果顯示，模型組大鼠缺血的海馬神經(jīng)細(xì)胞胞體腫脹，細(xì)胞由多極形變?yōu)閳A形，胞核移位，尼氏體減少甚至消失，Caspase-12蛋白表達(dá)/基因轉(zhuǎn)錄明顯上調(diào)，表現(xiàn)為細(xì)胞凋亡征象。

Caspases-12定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的外膜，是介導(dǎo)ERS凋亡的關(guān)鍵分子。Caspase-12缺陷鼠能抵抗ERS引起的凋亡，而其他死亡刺激仍可誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡，表明Caspase-12與ERS介導(dǎo)凋亡的機(jī)制有關(guān)，而與非ERS介導(dǎo)的凋亡無關(guān)〔10〕。本研究發(fā)現(xiàn)，在腦缺血再灌注初期Caspase-12表達(dá)不明顯，隨著再灌注時(shí)間的延長逐漸升高，在24 h時(shí)達(dá)到高峰。分析可能在ERS初期，ERS誘導(dǎo)了未折疊蛋白質(zhì)反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)，形成自我保護(hù)通路〔11〕，但是當(dāng)ERS的時(shí)間過長時(shí)，ERS就會(huì)啟動(dòng)凋亡途徑，激活Caspase-12，表現(xiàn)為缺血再灌注后期Caspase-12的表達(dá)上調(diào)。以上機(jī)制尚待進(jìn)一步研究，但可推測對(duì)其適當(dāng)干預(yù)可能成為腦缺血再灌注損傷的潛在治療靶點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)，與模型組相比較，無論在Caspase-12蛋白表達(dá)還是基因轉(zhuǎn)錄水平，DCSI組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的海馬組織內(nèi)檢測水平均較低，并且DCSI組大鼠的神經(jīng)行為學(xué)改變相對(duì)較輕，反映細(xì)胞蛋白合成功能的尼氏體減少程度也較輕，細(xì)胞凋亡數(shù)明顯減少，推測DCSI可能通過抑制Caspase-12的表達(dá)和活化，從而抑制由Caspase-12介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的神經(jīng)元的損傷和凋亡，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

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