徐永中 朱 靈 范 鈺 焦志軍 (江蘇大學附屬醫(yī)院，江蘇 鎮(zhèn)江 2200)

近年研究發(fā)現(xiàn)，survivin與肺癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)〔1，2〕。但其內(nèi)在機制尚不清楚。小干擾RNA(siRNA)又稱RNA干涉(RNAi)，能夠使基因表達的mRNA被相應的雙鏈RNA分子敲除，其效果要遠強于正義和反義RNA。研究表明，參與這種RNAi作用的主要分子是雙鏈RNA，在細胞內(nèi)以21～23個核苷酸的形式發(fā)揮作用，且已有人工合成的雙鏈siRNA，具有明顯的敲除相應基因mRNA的效果〔3〕。本研究采用針對survivin基因的siRNA轉(zhuǎn)染處理人肺癌細胞，觀察對肺癌侵襲和Akt信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人肺癌A549細胞，江蘇大學附屬人民醫(yī)院腫瘤研究所凍存。survivinsiRNA序列:5'-AAGCAUUCGUCCGGUUGCGCU-3'〔4〕，由上海生工生物工程公司合成。survivin單克隆抗體，購自 Santa Cruz公司。TRIzol，RNase inhibitor，逆轉(zhuǎn)錄酶SSRTⅡ，Taq酶和轉(zhuǎn)染試劑Oligofectamine購自美國Invitrogen公司。

1.2 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 肺癌A549細胞在含10%新生牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，37℃、5%CO2、飽和濕度環(huán)境的條件下連續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前1 d，將1.0×105對數(shù)期生長的細胞接種于24孔培養(yǎng)板，1 ml/孔，培養(yǎng)過夜。次日進行轉(zhuǎn)染?；静僮靼凑照f明書進行。分組:(1)siRNA組:含10%胎牛血清的RPMI 1640中含不同濃度(0.75、1.50和3.00 nmol/L)的已用脂質(zhì)體包埋的siRNA。(2)空白對照組:siRNA組的siRNA用RPMI 1640替代。轉(zhuǎn)染后于不同時間采用胰酶消化收取細胞，進行以下試驗。

1.3 方法

1.3.1 survivin基因mRNA水平檢測 應用TRIzol抽提細胞總RNA，取總RNA 1 μg，以oligo dT為引物逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA第一鏈，以此cDNA鏈2 μl為模板進行PCR擴增，步驟參照說明書。引物序列為:上游:5'-ATTTGAATCGCGGGACCC-3';下游:5'-GAGAAAGGGCTGCCA GGC-3'。6-羥基熒光素(FAM)探針:5'-CATGGGTGCCCCGACGTTGC-3'-TAMRA。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參。PCR反應條件為:95℃預變性3 min，95℃，30 s;52℃，45 s;72℃，45 s;35 個循環(huán)后再 72C 延伸7 min。實時定量PCR結(jié)果參照文獻〔5〕方法計算。

1.3.2 survivin基因蛋白水平檢測 提取各組細胞總蛋白，蛋白定量后，以β-肌動蛋白(β-actin)為內(nèi)對照，進行常規(guī)Western印跡檢測。

1.3.3 軟瓊脂集落形成實驗 常規(guī)進行軟瓊脂集落培養(yǎng)實驗，觀測survivin siRNA對肺癌細胞錨著不依賴性增殖的影響。

1.3.4 體外侵襲實驗 參照Albini等〔6〕的方法。在改良的Boyden小室中進行，Boyden小室的上下室之間隔以直徑為3 mm的聚碳酸酯膜(PVP孔徑為8 μm)，膜上鋪勻1∶2稀釋的基底膜膠。下室加預先制備的小鼠胚胎成纖維細胞(NIH3T3)培養(yǎng)上清液作為趨化因子，上室加入50～800 μl待測的腫瘤細胞懸液。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中溫育12 h，棄去上室液體，取出聚碳酸酯膜，用棉簽仔細擦盡膜上Matrigel及未穿過的細胞，甲醛固定5 min，蘇木素-伊紅(HE)染色。400倍光鏡下計數(shù)穿過聚碳酸酯膜的細胞數(shù)，以侵襲細胞的相對數(shù)目表示腫瘤細胞侵襲能力。隨機計數(shù)5個視野內(nèi)的細胞數(shù)，取平均值進行統(tǒng)計處理，每組計數(shù)3份樣本。

1.3.5 細胞Akt磷酸化水平檢測 提取各組細胞總蛋白，蛋白定量后，以總Akt為對照，進行常規(guī)Western印跡檢測。

1.4 統(tǒng)計學方法 應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析，所測得的數(shù)據(jù)用表示。

2 結(jié)果

2.1 siRNA轉(zhuǎn)染對survivin基因的影響 采用定量PCR和Western印跡檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組細胞比較，siRNA組mRNA和蛋白水平明顯降低。見圖1，圖2。

圖1 survivin siRNA轉(zhuǎn)染對肺癌A549細胞survivin mRNA水平的影響

圖2 survivin siRNA轉(zhuǎn)染對肺癌A549細胞survivin蛋白水平的影響(48 h)

2.2 軟瓊脂集落形成實驗 肺癌A549細胞在體外半固體培養(yǎng)體系中可以自發(fā)地形成集落，而經(jīng)siRNA轉(zhuǎn)染的細胞集落生長呈劑量依賴性減少。當 siRNA濃度為 0.75、1.50、3.00 nmol/L時集落數(shù)分別為18±1.9、12±1.8、7±1.6，與對照組集落數(shù)27±2.1比較，siRNA組軟瓊脂集落形成數(shù)明顯降低(P ＜0.05，P ＜0.01)。

2.3 survivin siRNA對肺癌細胞侵襲的影響 收集轉(zhuǎn)染48 h的細胞，采用Boyden小室檢測癌細胞侵襲情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當siRNA濃度為0.75、1.50、3.00 nmol/L時，穿膜細胞數(shù)分別為39±1.5、25±1.6、12±1.8，與對照組集落數(shù) 56±2.2比較，siRNA組穿過濾膜的細胞數(shù)明顯下降(P＜0.05，P＜0.01)。

2.4 survivin siRNA對肺癌細胞Akt信號通路的影響 Western印跡結(jié)果顯示，A549細胞有較高水平的磷酸化，經(jīng)siRNA轉(zhuǎn)染處理后，磷酸化水平明顯降低。見圖3。

圖3 siRNA(3 nmol/L)對肺癌細胞Akt信號通路的影響

3 討論

survivin基因是凋亡抑制蛋白家族的重要成員。survivin在胚胎發(fā)育過程中表達，在發(fā)育后的成年組織中不表達，但它在許多轉(zhuǎn)化的細胞系和許多腫瘤中重新表達〔6〕。survivin在卵巢癌、喉癌、乳腺癌、膽管癌中起重要的作用，是一個重要的預后指標〔7〕。與口腔癌、胃癌、前列腺癌、肺癌轉(zhuǎn)移有關(guān)〔8〕。但尚不清楚其內(nèi)在機制。本研究發(fā)現(xiàn)，survivin siRNA可以抑制肺癌細胞的錨著不依賴性增殖和惡性侵襲能力，提示survivin基因在人肺癌細胞侵襲中可能起到重要的作用。

正常真核細胞，除成熟血細胞外，大多須黏附于特定的細胞外基質(zhì)上才能抑制凋亡而存活，稱為錨著依賴性。腫瘤細胞可以錨著不依賴性生長。腫瘤細胞在軟瓊脂形成集落的多少可反映腫瘤細胞錨著依賴性的特性，且與其惡性程度呈正相關(guān)。癌細胞侵襲能力強，則在軟瓊脂上形成的集落數(shù)目多。本研究發(fā)現(xiàn)，肺癌細胞經(jīng)不同濃度的survivin siRNA處理后，可明顯抑制癌細胞在軟瓊脂集落的形成，且呈劑量依賴性。Boyden小室模型檢測發(fā)現(xiàn)，經(jīng)siRNA處理后的肺癌細胞穿膜細胞數(shù)減少，且呈濃度依賴性。說明，survivin siRNA可一定程度上抑制肺癌細胞的錨著不依賴性增殖和侵襲能力。

癌細胞侵襲是一個復雜的過程，涉及很多機制。研究發(fā)現(xiàn)，Akt信號通路在許多惡性腫瘤細胞增殖侵襲中起著重要作用。Akt也稱蛋白激酶B，是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，其激酶結(jié)構(gòu)域與蛋白激酶A、C都有70%的同源性〔9〕。它可以被許多生長因子如血小板衍生生長因子、表皮生長因子和神經(jīng)生長因子等通過PI-3 K途徑激活，激活的Akt可以磷酸化胱冬蛋白酶-9(caspase-9)前體蛋白和Bad而使它們失活，從而在保護細胞免于凋亡中起著重要作用〔10〕。本研究發(fā)現(xiàn)，survivin siRNA可對肺癌細胞Akt磷酸化水平有效地抑制，且呈濃度依賴性。

本研究提示，抑制Akt磷酸化水平，是survivin siRNA下調(diào)

人

肺癌細胞錨著不依賴性增殖和惡性侵襲的重要機制之一。

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