徐永中 朱 靈 范 鈺 焦志軍 (江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 鎮(zhèn)江 2200)

近年研究發(fā)現(xiàn)，survivin與肺癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)〔1，2〕。但其內(nèi)在機(jī)制尚不清楚。小干擾RNA(siRNA)又稱RNA干涉(RNAi)，能夠使基因表達(dá)的mRNA被相應(yīng)的雙鏈RNA分子敲除，其效果要遠(yuǎn)強(qiáng)于正義和反義RNA。研究表明，參與這種RNAi作用的主要分子是雙鏈RNA，在細(xì)胞內(nèi)以21～23個核苷酸的形式發(fā)揮作用，且已有人工合成的雙鏈siRNA，具有明顯的敲除相應(yīng)基因mRNA的效果〔3〕。本研究采用針對survivin基因的siRNA轉(zhuǎn)染處理人肺癌細(xì)胞，觀察對肺癌侵襲和Akt信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人肺癌A549細(xì)胞，江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院腫瘤研究所凍存。survivinsiRNA序列:5'-AAGCAUUCGUCCGGUUGCGCU-3'〔4〕，由上海生工生物工程公司合成。survivin單克隆抗體，購自 Santa Cruz公司。TRIzol，RNase inhibitor，逆轉(zhuǎn)錄酶SSRTⅡ，Taq酶和轉(zhuǎn)染試劑Oligofectamine購自美國Invitrogen公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 肺癌A549細(xì)胞在含10%新生牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，37℃、5%CO2、飽和濕度環(huán)境的條件下連續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前1 d，將1.0×105對數(shù)期生長的細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板，1 ml/孔，培養(yǎng)過夜。次日進(jìn)行轉(zhuǎn)染?；静僮靼凑照f明書進(jìn)行。分組:(1)siRNA組:含10%胎牛血清的RPMI 1640中含不同濃度(0.75、1.50和3.00 nmol/L)的已用脂質(zhì)體包埋的siRNA。(2)空白對照組:siRNA組的siRNA用RPMI 1640替代。轉(zhuǎn)染后于不同時間采用胰酶消化收取細(xì)胞，進(jìn)行以下試驗。

1.3 方法

1.3.1 survivin基因mRNA水平檢測 應(yīng)用TRIzol抽提細(xì)胞總RNA，取總RNA 1 μg，以oligo dT為引物逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA第一鏈，以此cDNA鏈2 μl為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，步驟參照說明書。引物序列為:上游:5'-ATTTGAATCGCGGGACCC-3';下游:5'-GAGAAAGGGCTGCCA GGC-3'。6-羥基熒光素(FAM)探針:5'-CATGGGTGCCCCGACGTTGC-3'-TAMRA。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參。PCR反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性3 min，95℃，30 s;52℃，45 s;72℃，45 s;35 個循環(huán)后再 72C 延伸7 min。實時定量PCR結(jié)果參照文獻(xiàn)〔5〕方法計算。

1.3.2 survivin基因蛋白水平檢測 提取各組細(xì)胞總蛋白，蛋白定量后，以β-肌動蛋白(β-actin)為內(nèi)對照，進(jìn)行常規(guī)Western印跡檢測。

1.3.3 軟瓊脂集落形成實驗 常規(guī)進(jìn)行軟瓊脂集落培養(yǎng)實驗，觀測survivin siRNA對肺癌細(xì)胞錨著不依賴性增殖的影響。

1.3.4 體外侵襲實驗 參照Albini等〔6〕的方法。在改良的Boyden小室中進(jìn)行，Boyden小室的上下室之間隔以直徑為3 mm的聚碳酸酯膜(PVP孔徑為8 μm)，膜上鋪勻1∶2稀釋的基底膜膠。下室加預(yù)先制備的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(NIH3T3)培養(yǎng)上清液作為趨化因子，上室加入50～800 μl待測的腫瘤細(xì)胞懸液。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中溫育12 h，棄去上室液體，取出聚碳酸酯膜，用棉簽仔細(xì)擦盡膜上Matrigel及未穿過的細(xì)胞，甲醛固定5 min，蘇木素-伊紅(HE)染色。400倍光鏡下計數(shù)穿過聚碳酸酯膜的細(xì)胞數(shù)，以侵襲細(xì)胞的相對數(shù)目表示腫瘤細(xì)胞侵襲能力。隨機(jī)計數(shù)5個視野內(nèi)的細(xì)胞數(shù)，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計處理，每組計數(shù)3份樣本。

1.3.5 細(xì)胞Akt磷酸化水平檢測 提取各組細(xì)胞總蛋白，蛋白定量后，以總Akt為對照，進(jìn)行常規(guī)Western印跡檢測。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，所測得的數(shù)據(jù)用表示。

2 結(jié)果

2.1 siRNA轉(zhuǎn)染對survivin基因的影響 采用定量PCR和Western印跡檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組細(xì)胞比較，siRNA組mRNA和蛋白水平明顯降低。見圖1，圖2。

圖1 survivin siRNA轉(zhuǎn)染對肺癌A549細(xì)胞survivin mRNA水平的影響

圖2 survivin siRNA轉(zhuǎn)染對肺癌A549細(xì)胞survivin蛋白水平的影響(48 h)

2.2 軟瓊脂集落形成實驗 肺癌A549細(xì)胞在體外半固體培養(yǎng)體系中可以自發(fā)地形成集落，而經(jīng)siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞集落生長呈劑量依賴性減少。當(dāng) siRNA濃度為 0.75、1.50、3.00 nmol/L時集落數(shù)分別為18±1.9、12±1.8、7±1.6，與對照組集落數(shù)27±2.1比較，siRNA組軟瓊脂集落形成數(shù)明顯降低(P ＜0.05，P ＜0.01)。

2.3 survivin siRNA對肺癌細(xì)胞侵襲的影響 收集轉(zhuǎn)染48 h的細(xì)胞，采用Boyden小室檢測癌細(xì)胞侵襲情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)siRNA濃度為0.75、1.50、3.00 nmol/L時，穿膜細(xì)胞數(shù)分別為39±1.5、25±1.6、12±1.8，與對照組集落數(shù) 56±2.2比較，siRNA組穿過濾膜的細(xì)胞數(shù)明顯下降(P＜0.05，P＜0.01)。

2.4 survivin siRNA對肺癌細(xì)胞Akt信號通路的影響 Western印跡結(jié)果顯示，A549細(xì)胞有較高水平的磷酸化，經(jīng)siRNA轉(zhuǎn)染處理后，磷酸化水平明顯降低。見圖3。

圖3 siRNA(3 nmol/L)對肺癌細(xì)胞Akt信號通路的影響

3 討論

survivin基因是凋亡抑制蛋白家族的重要成員。survivin在胚胎發(fā)育過程中表達(dá)，在發(fā)育后的成年組織中不表達(dá)，但它在許多轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系和許多腫瘤中重新表達(dá)〔6〕。survivin在卵巢癌、喉癌、乳腺癌、膽管癌中起重要的作用，是一個重要的預(yù)后指標(biāo)〔7〕。與口腔癌、胃癌、前列腺癌、肺癌轉(zhuǎn)移有關(guān)〔8〕。但尚不清楚其內(nèi)在機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)，survivin siRNA可以抑制肺癌細(xì)胞的錨著不依賴性增殖和惡性侵襲能力，提示survivin基因在人肺癌細(xì)胞侵襲中可能起到重要的作用。

正常真核細(xì)胞，除成熟血細(xì)胞外，大多須黏附于特定的細(xì)胞外基質(zhì)上才能抑制凋亡而存活，稱為錨著依賴性。腫瘤細(xì)胞可以錨著不依賴性生長。腫瘤細(xì)胞在軟瓊脂形成集落的多少可反映腫瘤細(xì)胞錨著依賴性的特性，且與其惡性程度呈正相關(guān)。癌細(xì)胞侵襲能力強(qiáng)，則在軟瓊脂上形成的集落數(shù)目多。本研究發(fā)現(xiàn)，肺癌細(xì)胞經(jīng)不同濃度的survivin siRNA處理后，可明顯抑制癌細(xì)胞在軟瓊脂集落的形成，且呈劑量依賴性。Boyden小室模型檢測發(fā)現(xiàn)，經(jīng)siRNA處理后的肺癌細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)減少，且呈濃度依賴性。說明，survivin siRNA可一定程度上抑制肺癌細(xì)胞的錨著不依賴性增殖和侵襲能力。

癌細(xì)胞侵襲是一個復(fù)雜的過程，涉及很多機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，Akt信號通路在許多惡性腫瘤細(xì)胞增殖侵襲中起著重要作用。Akt也稱蛋白激酶B，是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，其激酶結(jié)構(gòu)域與蛋白激酶A、C都有70%的同源性〔9〕。它可以被許多生長因子如血小板衍生生長因子、表皮生長因子和神經(jīng)生長因子等通過PI-3 K途徑激活，激活的Akt可以磷酸化胱冬蛋白酶-9(caspase-9)前體蛋白和Bad而使它們失活，從而在保護(hù)細(xì)胞免于凋亡中起著重要作用〔10〕。本研究發(fā)現(xiàn)，survivin siRNA可對肺癌細(xì)胞Akt磷酸化水平有效地抑制，且呈濃度依賴性。

本研究提示，抑制Akt磷酸化水平，是survivin siRNA下調(diào)

人

肺癌細(xì)胞錨著不依賴性增殖和惡性侵襲的重要機(jī)制之一。

1 Ikehara M，Oshita F，Kameda Y，et al.Expression of survivin correlated with vessel invasion is a marker of poor prognosis in small adenocarcinoma of the lung〔J〕.Oncol Rep，2002;9(4):835-8.

2 Kren L，Brazdil J，Hermanova M，et al.Prognostic significance of anti-apoptosis proteins survivin and bcl-2 in non-small cell lung carcinomas:a clinicopathologic study of 102 cases〔J〕.Appl Immunohistochem Mol Morphol，2004;12(1):44-9.

3 Zamore PD，Tuschl T，Sharp PA，et al.RNAi:double-stranded RNA directs the ATP-dependent cleavage of mRNA at 21 to 23 nucleotide intervals〔J〕.Cell，2000;101(1):25-33.

4 Livak KJ，Schmittgen TD.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCt method〔J〕.Methods，2001;25:402-8.

5 Albini A，Iwamoto Y，Kleinman HK，et al.A rapid in vitro assay for quantitating the invasion potential of tumor cells〔J〕.Cancer Res，1987;47(5):3239-45.

6 Adida C，Crotty PL，McGrath J，et al.Developmentally regulated expression of the novel cancer anti-apoptosis gene survivin in human and mouse differentiation〔J〕.Am J Pathol，1998;52(1):43-9.

7 Javle MM，Tan D，Yu J，et al.Nuclear survivin expression predicts poor outcome in cholangiocarcinoma〔J〕.Hepatogastroenterology，2004;51(60):1653-7.

8 Lo Muzio L，Pannone G，Staibano S，et al.Survivin expression in oral squamous cell carcinoma〔J〕.Br J Cancer，2003;89(12):2244-8.

9 Marte BM，Downward J.PKB/Akt:connecting phosphoinositide 3-kinase to cell survival and beyond〔J〕.Trends Biochem Sci，1997;22(9):355-8.

10 Cantley LC，Neel BG.New insights into tumor suppression:PTEN suppresses tumor formation by restraining the phosphoinositide 3-kinase/AKT pathway〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，1999;96(8):4240-5.