張 梅 李 萍 孫海玲 李艷英 班 博 (濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，山東 濟(jì)寧 272000)

2型糖尿病以胰島素抵抗和β細(xì)胞功能缺陷為主要的病理生理基礎(chǔ)，胰島素抵抗是指胰島素的靶器官 (包括骨骼肌、脂肪等)對(duì)一定量的胰島素的生物學(xué)反應(yīng)低于預(yù)計(jì)正常水平的一種現(xiàn)象，它可導(dǎo)致胰島素介導(dǎo)下的骨骼肌、脂肪組織對(duì)葡萄糖的攝取、利用或儲(chǔ)存的效力減弱，機(jī)體胰島β細(xì)胞代償出現(xiàn)高胰島素血癥，并逐漸出現(xiàn)高血糖。正常狀態(tài)下骨骼肌及脂肪組織對(duì)葡萄糖的攝取是維持體內(nèi)葡萄糖代謝合成平衡重要因素。目前國(guó)內(nèi)外眾多的研究已證實(shí)UCP2可以通過影響ATP的生成、調(diào)節(jié)胰島素的分泌、抑制氧自由基 (ROS)的生成、誘發(fā)胰島β細(xì)胞的凋亡等參與糖尿病的發(fā)生發(fā)展過程，并也因此成為了治療2型糖尿病的新的研究熱點(diǎn)。本研究通過觀察2型糖尿病糖尿病大鼠糖脂代謝、氧化應(yīng)激水平及UCP2 mRNA表達(dá)水平及之間的相互影響，并觀察α－硫辛酸 (LA)對(duì)其的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試驗(yàn)儀器與藥品 微量血糖儀(One TouchⅡ型，美國(guó)強(qiáng)生公司)及相應(yīng)型號(hào)試紙，糖化血紅蛋白(HbAlc)測(cè)定儀(BIO－RAD REF 220－0101)，全自動(dòng)生化分析儀(HITACHI 7600－120)，電子天平(上海良平Y(jié)P6001)，鏈脲佐菌素(STZ)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，LA(產(chǎn)品批號(hào) 2574)購(gòu)自德國(guó)STADA公司，總RNA提取試劑Trizol及CR SuperMix購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，瓊脂糖購(gòu)自北京世紀(jì)銀豐科技發(fā)展中心，丙二醛(MDA)及總抗氧化能力(T－AOC)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性Wistar大鼠30只，體重180～200 g，購(gòu)自山東省新華魯抗動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心(許可證號(hào)為:SCXK魯20080002)，飼養(yǎng)溫度(22±1)℃，濕度40% ～60%，光－暗周期12 h。用普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后隨機(jī)分為對(duì)照(NC)組8只和實(shí)驗(yàn)組22只，NC組繼續(xù)普通飼料喂養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組改用高脂飼料喂養(yǎng)，基礎(chǔ)飼料購(gòu)自山東省新華魯抗動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，高脂飼料是在60%的基礎(chǔ)飼料中加入5%蛋黃粉、20%蔗糖和15%豬油混合而成。飼養(yǎng)期間大鼠的精神狀態(tài)、攝食、飲水及活動(dòng)情況均未見明顯異常，無死亡。

1.3 方法 實(shí)驗(yàn)組大鼠高脂飼養(yǎng)4 w后，禁食12 h，將STZ溶于0.1 mol/L枸櫞酸－枸櫞酸鈉緩沖液(pH4.2)溶液中，配成濃度為1%的溶液，單次腹腔注射30 mg/kg，NC組給予等量的枸櫞酸－枸櫞酸鈉緩沖液腹腔注射，72 h后尾靜脈測(cè)血糖，血糖＞16.7 mmol/L為造模成功，共成模18只，隨機(jī)選取16只成模者納入本實(shí)驗(yàn)，繼續(xù)高脂飲食4 w后隨機(jī)分為L(zhǎng)A、糖尿病(DC)組，每組8 只，分別給予 LA 60 mg·kg－1·d－1、生理鹽水2 ml/d 4 w，實(shí)驗(yàn)期間，動(dòng)物自由攝食和飲水。每周測(cè)一次血糖和體重。

1.4 標(biāo)本收集與檢測(cè) 用藥4 w后，禁食12 h，1%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，開胸，胸主動(dòng)脈抽血檢測(cè)HbA1c、血糖、血脂，取出肝臟－80℃冰箱凍存?zhèn)溆脺y(cè) AMPKα。親和層析微柱法測(cè)HbA1c，血糖血脂胰島素由全自動(dòng)生化分析儀及全自動(dòng)電化學(xué)免疫分析儀測(cè)定;應(yīng)用RT－PCR檢測(cè)脂肪、骨骼肌組織UCP2 mRNA的表達(dá)水平;應(yīng)用比色法測(cè)定肝臟內(nèi) MDA及 T－AOC水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0軟件，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 各組體重變化 造模1 w后即在飼養(yǎng)5 w后NC組與DC、LA組相比差異顯著(P＜0.05)，DC組與LA組間體重?zé)o差異(P＞0.05)。見表1。

2.2 各組大鼠空腹血糖(FBG)、HbA1c及胰島素水平比較造模前各組大鼠FBG無明顯差異(P＞0.05)，至造模后實(shí)驗(yàn)組較正常組相比較FBG明顯升高，且胰島素亦明顯升高(P＜0.01);LA組與DC組比較FBG顯著降低，胰島素明顯下降(P＜0.05);各組大鼠HbA1c水平比較，與FBG變化趨勢(shì)一致。見表2。

2.3 各組大鼠血脂水平比較 與NC組相比較，DC組、LC組甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)均升高，高密度脂蛋白(HDL)下降(P＜0.05)，但LC組與NC組相比游離脂肪酸(FFA)無明顯差別(P＞0.05);與DC組相比較LA組TG、TC、LDL均有下降，HDL有明顯升高(P＜0.05或 P＜0.01)。見表3。

表1 各組大鼠體重變化(n=8，g，)

表1 各組大鼠體重變化(n=8，g，)

與NC組比較:1)P＜0.05

組別 1 w 造模后 用藥前 用藥后NC 196.5±9.4 347.5±13.0 411.3±16.2 421.9±15.2 DC 193.9±7.0 344.4±14.7 354.4±15.21)360.3±15.11)LA 195.0±9.7 361.0±14.7 359.4±17.21)365.0±16.31)

表2 各組大鼠FPG、HbA1c、胰島素水平比較(n=8，)

表2 各組大鼠FPG、HbA1c、胰島素水平比較(n=8，)

與NC組比較:1)P＜0.01;與DC組比較:2)P＜0.05

組別 FBG(mmol/L) 胰島素 HbA1c(%)NC 4.94±0.512) 8.51±1.272) 4.8±0.672)DC 23.32±2.871) 19.1±1.601) 13.0±1.561)LA 20.6±2.321)2) 14.08±1.791)2) 10.1±2.101)2)

表3 各組大鼠血脂水平比較(n=8，mmol/L，)

表3 各組大鼠血脂水平比較(n=8，mmol/L，)

與 NC組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01;與 DC組比較:3)P＜0.05，4)P＜0.01，下表同

組別TG TC LDL HDL FFA NC 0.48±0.164) 1.33±0.234) 0.31±0.064) 1.00±0.164)0.33±0.11 DC 3.75±0.452) 3.08±0.272) 1.46±0.282) 0.82±0.192) 0.53±0.102)LA 2.20±0.402)3) 2.21±0.311)3) 0.85±0.123) 0.95±0.223) 0.40±0.113)

2.4 各組大鼠脂肪及骨骼肌組織內(nèi)MDA、T－AOC的比較 與NC組比較，DC組LA組大鼠脂肪及骨骼肌組織內(nèi)MDA含量均有升高，而T－AOC均有下降(P＜0.05或者P＜0.01);與DC組比較，LA組大鼠脂肪及骨骼肌組織中MDA含量均有下降，T－AOC均有升高(P＜0.05或P＜0.0)。見表4。

表4 各組大鼠不同組織內(nèi)MDA水平的比較(nmol/mgprot，n=8，)

表4 各組大鼠不同組織內(nèi)MDA水平的比較(nmol/mgprot，n=8，)

組別 骨骼肌 脂肪NC 2.31±0.894) 1.33±0.234)DC 6.43±1.222) 3.08±0.272)LA 5.24±1.072)3) 2.21±0.311)3)

2.5 各組間UCP2 mRNA表達(dá)水平的比較 算出每個(gè)樣品及GDAH的灰度值。并用UCP2的灰度值除以GDAH灰度值得出比值(OD比值)。將以上數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。與NC組比較，DC組、LA組脂肪及骨骼肌組織內(nèi)UCP2 mRNA的表達(dá)明顯增加(P＜0.05或P＜0.01)，但在脂肪組織中的表達(dá)無明顯差異(P＞0.05);與DC組比較LA組各組織內(nèi)UCP2 mRNA的表達(dá)均明顯下降(P＜0.05)。見表5及圖1、圖2。

圖1 各組骨骼肌組織內(nèi)UCP2 mRNA的表達(dá)

表5 各組大鼠不同組織內(nèi)UCP2 mRNA表達(dá)水平(OD比值)的比較(n=8，)

表5 各組大鼠不同組織內(nèi)UCP2 mRNA表達(dá)水平(OD比值)的比較(n=8，)

組別 脂肪 骨骼肌NC 0.92±0.064) 0.77±0.104)DC 1.10±0.052) 1.05±0.082)LA 0.97±0.074) 0.95±0.062)3)

圖2 各組脂肪組織內(nèi)UCP2 mRNA的表達(dá)

3 討論

解耦聯(lián)蛋白2(UCP2)是一種解耦聯(lián)劑，它是線粒體內(nèi)膜載體家族的一員，作為線粒體內(nèi)膜上參與質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白質(zhì)，它具有控制活性氧產(chǎn)生、調(diào)節(jié)能量平衡、調(diào)節(jié)ATP產(chǎn)生速度、抗細(xì)胞凋亡等生理功能，參與許多疾病的病理生理學(xué)過程。實(shí)驗(yàn)研究提示其表達(dá)或功能異常與代謝性疾病及肥胖相關(guān)。

UCP2的表達(dá)受脂肪酸、血糖及一些激素調(diào)節(jié)的影響。目前脂肪酸對(duì)非胰島組織UCP2的誘導(dǎo)作用已經(jīng)得到了證實(shí)〔1〕。應(yīng)用油脂酸培養(yǎng)肝細(xì)胞12～16 h，結(jié)果顯示肝細(xì)胞內(nèi) UCP2 mRNA的表達(dá)增加8倍以上。同時(shí)亦有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的研究〔2〕表明用脂肪乳持續(xù)灌注大鼠24 h能顯著增加其心臟和骨骼肌中UCP2的表達(dá)。本研究顯示糖尿病大鼠TG、TC、LDL及FFA明顯升高，同時(shí)HDL明顯降低，并且其骨骼肌及脂肪組織內(nèi)UCP2 mRNA的表達(dá)均明顯升高，與以往研究結(jié)果一致。有研究〔3～5〕表明α－硫辛酸可通過多種機(jī)制調(diào)節(jié)糖尿病狀態(tài)下的脂代謝紊亂，本研究結(jié)果證實(shí)了LA對(duì)脂代謝的調(diào)節(jié)作用及血脂對(duì)UCP2 mRNA的調(diào)節(jié)作用。血脂對(duì)UCP2 mRNA表達(dá)的調(diào)節(jié)機(jī)制尚不明確，有細(xì)胞內(nèi)的實(shí)驗(yàn)研究〔6〕表明，其可能機(jī)制為通過未酰化的脂肪酸激活過氧化物酶體激活受體 γ(PPAR γ)作用于UCP2 mRNA的啟動(dòng)調(diào)控區(qū)，而被此作用元件調(diào)控而上調(diào)表達(dá)。

目前高血糖對(duì)UCP2的影響結(jié)果不盡相同。Hjeltnes等〔7〕通過給予給予大鼠葡萄糖負(fù)荷后檢測(cè)肌肉中UCP2 mRNA的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)其與血漿葡萄糖水平呈正相關(guān)。UCP2基因敲除小鼠體內(nèi)胰島素水平升高，雜合型(UCP2+/－)鼠的胰島素分泌能力介于野生型(UCP2+/+)和基因敲除型(UCP2－/－)之間〔8，9〕。Krauss 等〔10，11〕的研究表明高血糖能上調(diào)胰島細(xì)胞線粒體的UCP2表達(dá)，同時(shí)ROS的產(chǎn)生增加，進(jìn)而抑制胰島素的分泌，在協(xié)同高脂的環(huán)境下，ROS生成的增多誘導(dǎo)UCP2的表達(dá)增多，UCP2的超表達(dá)將進(jìn)一步抑制胰島素分泌，加重高血糖。本研究結(jié)果顯示糖尿病大鼠血糖及胰島素水平均升高，同時(shí)外周組織中UCP2mRNA表達(dá)增加。但也有研究〔12〕表明糖尿病病狀態(tài)下機(jī)體外周組織內(nèi)UCP2 mRNA的表達(dá)較正常機(jī)體下降。其結(jié)果與上述結(jié)果不盡相同可能與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)時(shí)間、實(shí)驗(yàn)方法、實(shí)驗(yàn)技術(shù)及樣本量等有關(guān)。國(guó)內(nèi)外的研究均已證實(shí)〔13～15〕LA對(duì)糖尿病大鼠血糖具有調(diào)節(jié)作用，本研究證實(shí)了高血糖可增加UCP2 mRNA的表達(dá)，認(rèn)為高糖血癥上調(diào)UCP2 mRNA的表達(dá)可能是機(jī)體用來限制血糖無限升高的一種適應(yīng)機(jī)制，其機(jī)制尚不明確。同時(shí)也證實(shí)了UCP2是β細(xì)胞胰島素分泌的一個(gè)重要的調(diào)節(jié)因子，認(rèn)為可能是UCP2通過解耦聯(lián)作用導(dǎo)致ATP合成減少進(jìn)而出現(xiàn)ATP/ADP比值降低，使ATP敏感性K+通道(K+－ATP通道)關(guān)閉，出現(xiàn)細(xì)胞膜去極化，從而通過打開電壓門控鈣通道，導(dǎo)致Ca2+內(nèi)流的增加，進(jìn)而促進(jìn)β細(xì)胞通過胞吐作用將胰島素釋放，機(jī)體為此所必須付出的代價(jià)是能量通過UCPs的作用以熱能的形式被消耗，而不是以 ATP形式被儲(chǔ)存，UCP2的這種質(zhì)子傳遞作用能被細(xì)胞內(nèi)的ADP抑制。

UCP2被認(rèn)為是介導(dǎo)線粒體ROS的生成，最近的很多研究都證實(shí)UCP2是不同組織 ROS生成的調(diào)節(jié)器〔16～18〕，更有趣的是研究發(fā)現(xiàn)〔10，18，19〕，UCP2 可調(diào)節(jié) ROS 的生成，同時(shí) ROS 分子可激活UCP2，UCP2對(duì) ROS的調(diào)節(jié)是一個(gè)負(fù)反饋。Li等〔20〕的研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激可使胰島β細(xì)胞和肥胖者肝細(xì)胞中UCP2表達(dá)增加，表達(dá)增高的UCP2可增強(qiáng)β細(xì)胞H2O2毒性的對(duì)抵抗力。上述研究表明UCP2可調(diào)節(jié)ROS的生成，同時(shí)也顯示UCP2的表達(dá)也受ROS分子的調(diào)節(jié)。眾多的臨床及動(dòng)物研究已證實(shí)糖尿病狀態(tài)下機(jī)體抗氧化能力下降，氧化應(yīng)激明顯增強(qiáng)〔21～25〕。本研究提示糖尿病狀態(tài)下機(jī)體的氧化－抗氧化系統(tǒng)失調(diào)，抗氧化能力明顯下降，氧化應(yīng)激明顯增強(qiáng)，與上述研究結(jié)果一致。LA可以通過調(diào)節(jié)氧化系統(tǒng)與抗氧化系統(tǒng)之間的平衡，改善糖尿病機(jī)體的氧化應(yīng)激水平，并且本研究潛在的提示了氧化應(yīng)激水平與UCP2 mRNA的表達(dá)水平兩者是一個(gè)負(fù)反饋。

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