韓 博 蔣依紋 張 晨 周 悅 王 毅 (吉林大學(xué)藥學(xué)院，吉林 長春 130021)

腫瘤干細胞是實體腫瘤組織內(nèi)具有自我更新能力的細胞亞群，能夠分化為多種細胞系而引起腫瘤的形成〔1〕。研究證明，結(jié)腸癌的復(fù)發(fā)是由具有顯著增殖能力但數(shù)量稀少的腫瘤干細胞引起的。研究表明，人參皂苷Rg3對乳腺癌、肺癌、胃癌、肝癌及宮頸腺癌等多種腫瘤細胞具有抑制作用〔2～4〕。但現(xiàn)有研究主要集中于人參皂苷Rg3的R型，對于其同型異構(gòu)體S型〔Rg3(S)〕的研究，特別是其對腫瘤干細胞作用的研究甚少。本實驗擬選用人結(jié)腸癌細胞株HCT-116作為研究對象，觀察Rg3(S)對結(jié)腸癌干細胞增殖及凋亡的影響，為Rg3(S)的抗結(jié)腸癌作用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養(yǎng)細胞 人結(jié)腸癌細胞株HCT-116購于中科院上海細胞庫，在含10%胎牛血清的McCoy'S 5A培養(yǎng)液中，置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑 標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清、McCoy'S 5A、DMEM/F12培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶、B27(50×)(Gibco公司);免疫磁珠試劑盒、表面細胞生長因子(EGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)(Sigma公司);Biotin-上皮特異性黏附分子(EpCAM)單抗及Biotin-CD44單抗(eBioscience);膽囊收縮素8肽(CCK-8)(日本同仁);乙二胺四乙酸(EDTA)、二甲基亞砜(DMSO)(上海生工);半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-9及Caspase-3分光光度檢測試劑盒(南京凱基生物);Rg3(S)(吉林大學(xué))。

1.2 方法

1.2.1 EpCAMhighCD44+HCT-116結(jié)腸癌干細胞的篩選 以EpCAM及CD44作為結(jié)腸癌干細胞篩選標(biāo)記，利用Biotin標(biāo)記抗體和免疫磁珠法篩選EpCAMhighCD44+結(jié)腸癌干細胞，篩選得到的EpCAMhighCD44+HCT-116細胞培養(yǎng)于含100 U/ml青霉素、100 U/ml 鏈霉素、2 μg/ml EGF、2 μg/ml bFGF、B27 的DMEM/F12無血清培養(yǎng)基中，37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)，待結(jié)腸癌干細胞的微球生長至100個細胞時，傳代，每3～5 d換液1次。

1.2.2 誘導(dǎo)分化實驗 收集對數(shù)生長期EpCAMhighCD44+HCT-116細胞，重懸于含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng);觀察 EpCAMhighCD44+HCT-116細胞的形態(tài)變化。

1.2.3 細胞生長曲線的測定 取對數(shù)生長期的結(jié)腸癌HCT-116細胞及EpCAMhighCD44+HCT-116細胞，接種于96孔板，每孔 500 個細胞，分別于 6、8、12、16、20、24、28、32、36、48、72、96 h后，利用CCK-8試劑盒檢測OD450 nm，繪制生長曲線。

1.2.4 Rg3(S)對EpCAMhighCD44+HCT-116細胞的時效/量效關(guān)系確定 取對數(shù)生長期的EpCAMhighCD44+HCT-116細胞，以5 000/孔的密度接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后加藥。每組設(shè)3個復(fù)孔，分別加入終濃度為 80、160、320、640、1 280、2 560、5 120 μg/ml人參皂苷Rg3(S)(實驗組);不加藥物的細胞為對照組。分別于孵育 3、6、9、12、24、48、72 h 后以 CCK-8 測定OD450 nm。細胞抑制率=實驗組OD值/(對照組OD值－實驗組OD)×100%。

1.2.5 Rg3(S)對EpCAMhighCD44+HCT-116細胞增殖的抑制作用 取對數(shù)生長期的 EpCAMhighCD44+HCT-116細胞，以5 000/孔的密度接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后，分別加入終濃度為 160、320、640 μg/ml的 Rg3(S);30 μg/ml絲裂霉素(陽性對照);不加藥物的細胞為陰性對照。藥物作用48 h后，以CCK-8法測其OD450 nm，檢測Rg3(S)對其增殖的抑制作用;細胞抑制率按公式計算，細胞抑制率=實驗組OD值/(對照組OD值－實驗組OD)×100%。

1.2.6 Caspase-9及Caspase-3的檢測 取對數(shù)生長期的Ep-CAMhighCD44+HCT-116細胞，以1×105/孔的密度接種于6孔板，培養(yǎng)48 h 后，分別加入終濃度為 160、320、640 μg/ml的 Rg3(S);30 μg/ml絲裂霉素(陽性對照);不加藥物的細胞為陰性對照組。藥物作用48 h后，收集細胞，按試劑盒說明提取蛋白，分光光度計測定OD405 nm。Caspase酶活性以O(shè)D誘導(dǎo)劑/OD陰性對照比值表示。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行分析，數(shù)據(jù)資料以表示，組間均數(shù)的比較采用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 EpCAMhighCD44+HCT-116細胞的形態(tài) 經(jīng)過無血清培養(yǎng)5～6 d后，可觀察到小的微球形成，每個球形體由10～20個細胞聚集而成。隨培養(yǎng)時間延長，可見球形體直徑增大，大小不一，折光性較強，懸浮于培養(yǎng)基中;將EpCAMhighCD44+HCT-116細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基后，原來懸浮生長的細胞逐漸貼壁生長。見圖1，圖2。

圖1 EpCAMhighCD44+HCT-116細胞的無血清培養(yǎng)(×200)

圖2 EpCAMhighCD44+HCT-116細胞的誘導(dǎo)分化(×200)

2.2 細胞增殖 EpCAMhighCD44+細胞的體外增殖速度略高于腫瘤細胞HCT-116，進入平臺期后二者增殖速度達到一致。見圖3。

2.3 Rg3(S)對EpCAMhighCD44+HCT-116細胞增殖的影響不同濃度的Rg3(S)對結(jié)腸癌干細胞EpCAMhighCD44+HCT-116的增殖均具有一定的抑制作用，其中Rg3(S)濃度為640 μg/ml、作用時間為48 h時，對細胞增殖的抑制率最高;48 h之后抑制作用達到平臺期。見圖4。

2.4 Rg3(S)對 EpCAMhighCD44+HCT-116細胞 Caspase-9及Caspase-3酶活性的影響 隨 Rg3(S)濃度增高，EpCAMhighCD44+HCT-116細胞中的Caspase-9和Caspase-3的酶活性也增強，并且經(jīng) 640 μg/ml Rg3(S)作用后，EpCAMhighCD44+HCT-116細胞中的Caspase-3活性顯著高于陽性藥物絲裂霉素組(P＜0.05)。提示Rg3(S)具有較強的促進EpCAMhighCD44+HCT-116細胞凋亡的作用。見表1。

圖3 生長曲線

圖4 Rg3(S)對EpCAMhighCD44+HCT-116細胞增殖的影響

表1Rg3(S)對EpCAMhighCD44+HCT-116細胞凋亡酶活性的影響()

表1Rg3(S)對EpCAMhighCD44+HCT-116細胞凋亡酶活性的影響()

與絲裂霉素組比較:1)P＜0.05

8.05±0.39 320 3.66±0.20 5.92±0.83 160 1.32±0.15 1.53±0.12絲裂霉素Caspase-3 Caspase-9 Rg3(S) 640 7.11±0.781)組別 劑量(μg/ml)30 1.78±0.16 6.92±0.58

3 討論

人參皂苷可以抑制腫瘤細胞生長，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，對化療有促進療效的作用〔5〕;動物實驗也顯示人參皂苷可以抑制小鼠體內(nèi)肝癌的生長和癌細胞增殖〔6〕。

本研究以細胞表面抗體EpCAM及CD44作為標(biāo)記，免疫磁珠法篩選結(jié)腸癌細胞HCT-116無血清條件下培養(yǎng)，3～7 d后可見明顯結(jié)腸癌干細胞微球，并且第2代結(jié)腸癌干細胞仍具有成球能力;在含血清的培養(yǎng)條件下進行誘導(dǎo)分化實驗，結(jié)腸癌干細胞在第3天呈貼壁狀態(tài)，提示其開始分化為結(jié)腸癌細胞;Rg3(S)作用24 h后細胞增殖明顯受到抑制，48 h時達最大抑制率，當(dāng)Rg3(S)濃度為640 μg/ml時，抑制率最高。

Caspase家族在介導(dǎo)細胞凋亡的過程中起著非常重要的作用;Caspase-9是級聯(lián)酶的上游分子，可被線粒體向細胞質(zhì)釋放的細胞色素C激活。激活的Caspase-9可引起下游級聯(lián)酶的活性，如Caspase-3〔7〕。Caspase-9在正常狀態(tài)下以酶原的形式存在于胞質(zhì)中，沒有活性;但在細胞發(fā)生凋亡階段時則被激活。

Caspase-3是細胞凋亡蛋白級聯(lián)反應(yīng)的必經(jīng)之路，活化的Caspase-3可活化其他Caspases和多種胞質(zhì)內(nèi)和核內(nèi)成分，因此通過檢測Caspase-3活性可了解細胞凋亡情況。本實驗觀察到Rg3(S)作用后，Caspase-9及Caspase-3的活性顯著增強，提示細胞發(fā)生凋亡〔8〕。

綜上所述，Rg3(S)可激活Caspase-9、Caspase-3途徑，抑制人結(jié)腸癌干細胞的增殖，促進細胞凋亡。然而，目前對Rg3(S)致凋亡機制的研究尚未完善。本研究為今后進一步探索Rg3(S)對結(jié)腸癌干細胞的作用機制奠定了基礎(chǔ)。

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