沈梅紅 劉曉華 項(xiàng)曉人 沈 潔 張 瑩 舒兆瑞 李忠仁

(南京中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210046)

N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體屬于興奮性氨基酸-谷氨酸離子型受體的一種，由NR1和NR2兩種亞單位組成，NR2是其調(diào)節(jié)亞單位，對整個(gè)受體通道的功能起修飾作用。NMDA受體不僅參與體內(nèi)神經(jīng)發(fā)育、學(xué)習(xí)記憶、興奮性突觸等多種生理過程，也參與傳遞神經(jīng)元死亡、缺血性腦損傷、血管性癡呆等許多重要的病理過程〔1，2〕。但目前關(guān)于針灸對腦組織NMDA受體亞單位的研究主要集中在海馬和皮質(zhì)區(qū)上〔3，4〕，而紋狀體是大腦中動(dòng)脈缺血再灌注時(shí)的主要受損腦區(qū)之一。為此，本文通過觀察電針對缺血再灌注后大鼠紋狀體NMDA受體調(diào)節(jié)亞單位NR2A和NR2B蛋白表達(dá)的變化，探討電針對缺血再灌注興奮性氨基酸毒性的拮抗作用，進(jìn)一步闡明電針治療缺血性腦血管疾病的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及腦缺血再灌注動(dòng)物模型制作 8月齡清潔級SD健康雄性大鼠15只，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司〔許可證號(hào):SCXK(滬)2007-0005〕。所有大鼠自由攝食和飲水，生活在晝夜節(jié)律為12 h/12 h且保持室溫25℃的空間內(nèi)，適應(yīng)性喂養(yǎng)至體質(zhì)量(300±20)g后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)過程中對動(dòng)物的處置符合國家科技部2006年頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》要求。用數(shù)字隨機(jī)表將動(dòng)物隨機(jī)分成制作模型大鼠10只、假手術(shù)組大鼠5只。模型動(dòng)物根據(jù)前期研究〔5〕，采用改良Longa線栓大腦中動(dòng)脈法制作局灶性腦缺血再灌注模型。假手術(shù)組大鼠的手術(shù)過程，除不插入線栓外，其余步驟與模型組一致。模型制作成功后，隨機(jī)分成模型組、電針組，各5只。具體如下:①模型組:制作大腦中動(dòng)脈短暫性缺血再灌注模型，不做治療。②假手術(shù)組:只做手術(shù)血管分離，不做血管結(jié)扎，不插入線栓及治療。③電針組:造模同模型組，再灌同時(shí)電針“百會(huì)”、“大椎”兩穴30 min。

1.2 藥品與試劑 水合氯醛(AR，批號(hào):30037517)購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，蒸餾水配制成10%的溶液;多聚甲醛(AR，批號(hào):20071217)購自成都科龍化學(xué)試劑廠，用0.01 mol/L PBS配成4%多聚甲醛溶液;多聚賴氨酸、0.01 mol/L PBS、檸檬酸鹽抗原修復(fù)液、二抗〔即用型二步法(非生物素)檢測試劑盒〕、3%過氧化氫溶液及DAB顯色試劑盒均購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;兔抗NR2A、NR2B單克隆抗體購于美國Abcam公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 Leica TP 1020型生物組織脫水機(jī)(德國);Leica RM 2145型石蠟切片機(jī)(德國);OLYMPUS-BX60生物組織顯微鏡(日本);OLYMPUS DP 71圖像獲取系統(tǒng)(日本);JD 801形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)軟件(江蘇省捷達(dá)科技發(fā)展有限公司);DHG-9070A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);WQ 1002K電針儀(安隆光電技術(shù)公司);華佗牌不銹鋼一次性毫針(φ0.35 mm×25 mm，蘇州醫(yī)療用品有限公司)。

1.4 電針方法 電針組大鼠在成功制備腦缺血再灌注模型后進(jìn)行電針治療“百會(huì)”、“大椎”兩穴，選穴標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》所附大鼠穴位圖譜?！鞍贂?huì)”穴平刺，“大椎”穴斜刺(約30°角)，深度均為10 mm。捻轉(zhuǎn)刺激30 s后，接電針儀，“百會(huì)”接負(fù)極，“大椎”接正極。刺激參數(shù):連續(xù)波，頻率3Hz，刺激強(qiáng)度以保持針刺局部輕微抖動(dòng)為度(電流強(qiáng)度1～3 mA，電壓1～3 V)。時(shí)間:30 min。

1.5 取材 各組大鼠再灌注24 h，經(jīng)10%水合氯醛(0.4 ml/100 g)腹腔注射深度麻醉后，開胸先后用0.9%氯化鈉溶液、4%多聚甲醛固定液各200 ml經(jīng)左心室及升主動(dòng)脈灌流，開顱取腦，置4%多聚甲醛溶液中固定過夜備用。將大腦沿冠狀面切成5等份腦片，取頭側(cè)第二片腦組織，浸泡在75%乙醇過夜。常規(guī)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋。

1.6 HE染色及NR2A、NR2B蛋白表達(dá) 將已包埋好的石蠟塊作冠狀面切片(片厚5 μm)，從出現(xiàn)紋狀體完整結(jié)構(gòu)開始取3張切片，分別用于HE染色及 NR2A、NR2B免疫組化檢測。NR2A、NR2B蛋白表達(dá)檢測方法，同參考文獻(xiàn)〔3〕進(jìn)行操作。

2 結(jié)果

2.1 大鼠腦組織紋狀體區(qū)形態(tài)學(xué)觀察 由圖1可觀察到:假手術(shù)組大鼠腦組織紋狀體區(qū)有大量神經(jīng)細(xì)胞分布，顆粒細(xì)胞呈橢圓形，細(xì)胞質(zhì)不豐富，核質(zhì)比大，核淡染清晰;可見少量錐體細(xì)胞，有長的突起，核漿比小，細(xì)胞核為圓形或橢圓形，著色為淺藍(lán)色，核仁深染，未見炎性細(xì)胞浸潤及細(xì)胞空泡變性和細(xì)胞壞死等。而模型組大鼠紋狀體區(qū)神經(jīng)細(xì)胞分布較少，其中許多細(xì)胞胞體縮小、胞核固縮、深染，可見神經(jīng)細(xì)胞壞死和凋亡，血管周圍、神經(jīng)細(xì)胞和纖維束水腫。電針組大鼠紋狀體神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)核固縮現(xiàn)象減輕，大小接近假手術(shù)組，神經(jīng)細(xì)胞分布情況接近于假手術(shù)組。

圖1 各組大鼠紋狀體形態(tài)學(xué)觀察(HE，×400)

2.2 大鼠局灶性腦缺血后紋狀體區(qū)NR2A、NR2B表達(dá)

2.2.1 NR2A陽性細(xì)胞表達(dá)及圖像分析結(jié)果 由圖2可知，假手術(shù)組NR2A蛋白在大鼠紋狀體神經(jīng)細(xì)胞有中等強(qiáng)度的陽性表達(dá)，陽性細(xì)胞多呈棕褐色，胞漿濃染，細(xì)胞排列分散在紋狀體陰性神經(jīng)細(xì)胞中;與假手術(shù)組相比，模型組細(xì)胞排列稀疏，陽性細(xì)胞少見，胞質(zhì)淡染;與模型組相比，電針組的陽性細(xì)胞數(shù)增多，胞質(zhì)染色變深，細(xì)胞排列分散在紋狀體陰性細(xì)胞中。從表1可知:與假手術(shù)組相比，模型組大鼠受損側(cè)紋狀體中表達(dá)NR2A蛋白的陽性細(xì)胞數(shù)、平均光密度值明顯降低，平均灰度值明顯升高。與模型組比較，電針組紋狀體中NR2A陽性細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞平均光密度值明顯增加，平均灰度值明顯降低，但仍與假手術(shù)組存在差異。

圖2 各組大鼠紋狀體NR2A表達(dá)情況(DAB，×400)

表1 各組大鼠紋狀體中NR2A陽性細(xì)胞數(shù)、平均灰度、平均光密度()

表1 各組大鼠紋狀體中NR2A陽性細(xì)胞數(shù)、平均灰度、平均光密度()

與假手術(shù)組比較:1)P＜0.05;與模型組比較:2)P＜0.05，下表同

陽性細(xì)胞數(shù) 平均灰度 平均光密度假手術(shù)組組別 n 5 96.25±7.04 113.10±11.08 0.36±0.04模型組 5 58.60±2.301) 147.35±6.341) 0.24±0.021)電針組 5 72.20±12.721)2)132.03±6.701)2) 0.29±0.021)2)

2.2.2 NR2B陽性細(xì)胞表達(dá)及圖像分析結(jié)果 由圖3可知，假手術(shù)組中NR2B蛋白在細(xì)胞體中有少量陽性表達(dá)，可見其散在分布于紋狀體神經(jīng)元中，胞質(zhì)染色較淡;與假手術(shù)組相比，模型組紋狀體神經(jīng)元中有高度表達(dá)，細(xì)胞排列紊亂，可見大量的陽性細(xì)胞，多呈棕褐色，胞質(zhì)深染;與模型組相比，電針組的陽性神經(jīng)元數(shù)目減少，染色變淡，細(xì)胞排列較稀疏。從表2可知大鼠紋狀體中NR2B表達(dá)結(jié)果:與假手術(shù)組相比，模型組紋狀體組織表達(dá)NR2B的陽性細(xì)胞數(shù)量、陽性細(xì)胞的平均光密度值明顯升高，平均灰度值明顯降低;與模型組比較，電針組紋狀體NR2B陽性細(xì)胞數(shù)、平均光密度值明顯降低，平均灰度值明顯升高。

圖3 各組大鼠紋狀體NR2B表達(dá)情況(DAB，×400)

表2 各組大鼠紋狀體中NR2B陽性細(xì)胞數(shù)、平均灰度、平均光密度()

表2 各組大鼠紋狀體中NR2B陽性細(xì)胞數(shù)、平均灰度、平均光密度()

陽性細(xì)胞數(shù) 平均灰度 平均光密度假手術(shù)組組別 n 5 61.00±4.55 142.08±8.89 0.25±0.02模型組 5 117.60±6.881) 109.68±9.111) 0.37±0.041)電針組 5 65.60±15.142) 126.00±6.301)2) 0.31±0.021)2)

3 討論

雖然腦缺血再灌注損傷后進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評分，操作簡便，可直接觀察干預(yù)措施的效果，易于廣泛應(yīng)用，但與腦損傷并不完全同步;而形態(tài)學(xué)觀察可作為評價(jià)腦缺血損傷情況的金指標(biāo)。本研究說明造?？梢源龠M(jìn)神經(jīng)元的損傷，而電針治療可以減少受損神經(jīng)元數(shù)，減輕缺血后引起的腦損傷。

各種原因引起的腦缺血缺氧，其受損局部組織的神經(jīng)元可釋放大量的興奮性氨基酸(EAA)，主要是谷氨酸(Glu)。再加上EAA重?cái)z取減少以及死亡細(xì)胞大量溢出EAA，神經(jīng)元壞死后小膠質(zhì)細(xì)胞也可產(chǎn)生大量的Glu〔6〕，致使細(xì)胞間隙的EAA濃度很快增加。而細(xì)胞間隙中超常量的EAA持續(xù)強(qiáng)烈地作用于細(xì)胞膜上的Glu受體亞型-NMDA受體，導(dǎo)致Na+、Ca2+經(jīng)受體門控通道大量內(nèi)流，引起Ca2+超載，進(jìn)而觸發(fā)一系列Ca2+依賴性反應(yīng)，造成神經(jīng)元進(jìn)一步損傷。因此認(rèn)為在缺血性腦損傷中NMDA受體發(fā)揮著關(guān)鍵作用，而該受體通道的調(diào)控被認(rèn)為是目前治療缺血性腦卒中的重要靶點(diǎn)〔7〕。從理論上講，若能抑制NMDA受體的活性，就能減少鈣內(nèi)流，有效地阻止NMDA受體介導(dǎo)的缺血性腦損傷的發(fā)生。

NMDA受體是由不同亞單位組成的異聚體，目前已發(fā)現(xiàn)生物體內(nèi)有3種NMDA受體亞基，分別是NR1、NR2和NR3。其中NR3主要在發(fā)育中的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)，不形成Glu激活通道。NR1是NMDA受體的功能亞基，在大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)廣泛分布，NR2是調(diào)節(jié)亞基，獨(dú)立存在時(shí)并不表達(dá)，它總是伴隨NR1存在于特定的腦區(qū)，增強(qiáng)NR1對興奮性氨基酸的反應(yīng)〔8〕，而NR2亞基包括NR2A、NR2B、NR2C和NR2D等亞單位。在成年大腦中，NR2A在大部分中樞神經(jīng)系統(tǒng)區(qū)域都有表達(dá)，而NR2B主要局限于前腦，NR2D在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的表達(dá)慢慢減少，主要在丘腦和腦干，NR2C則在小腦。NR2A和NR2B均能調(diào)節(jié)NMDA受體的活性，但兩者在缺血性腦損傷中所發(fā)揮的作用是完全相反的〔9〕:NR2A促進(jìn)神經(jīng)保護(hù)作用的發(fā)揮，其激活有利于神經(jīng)元的再生;而NR2B可介導(dǎo)自由基級聯(lián)反應(yīng)，產(chǎn)生興奮性毒性作用，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，且NR2B數(shù)目愈多，神經(jīng)元對興奮性氨基酸的毒性作用愈敏感。為此，本研究設(shè)計(jì)并對照觀察腦缺血再灌注大鼠在再灌注24 h時(shí)紋狀體中NMDA受體亞單位NR2A和NR2B的蛋白表達(dá)以及電針干預(yù)后兩者的變化。

本文表明腦缺血再灌注可引起大鼠受損側(cè)紋狀體組織中NMDA受體亞單位蛋白表達(dá)的改變，這與徐鐵軍等〔10〕研究前腦缺血再灌流后大鼠海馬NMDA受體亞單位NR2A和NR2B蛋白質(zhì)表達(dá)結(jié)果基本相符。而與模型組大鼠相比，給予電針“大椎”、“百會(huì)”穴治療后的大鼠紋狀體組織NR2A表達(dá)細(xì)胞數(shù)及含量均明顯升高，表達(dá)NR2B的細(xì)胞數(shù)及含量均明顯下降。結(jié)合前期研究推測，電針一方面可能通過激活局部神經(jīng)元表達(dá)大量NR2A受體蛋白，促進(jìn)受損紋狀體區(qū)域神經(jīng)元再生;另一方面通過阻抑NR2B受體蛋白的過量表達(dá)，來抑制自由基的大量生成，降低局部神經(jīng)元對興奮性氨基酸毒性作用的敏感性，從而調(diào)節(jié)NMDA受體復(fù)合物的整體功能活性，減少NMDA受體介導(dǎo)的興奮性氨基酸毒性反應(yīng)，減輕腦缺血再灌注引起的局灶性腦損傷，發(fā)揮一定的腦神經(jīng)保護(hù)作用。為了更深入探討電針對腦缺血再灌注大鼠的NMDA受體的影響，可采用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR等分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)一步研究。

1 王玉梅，劉永平，曹 凱，等.黃芩莖葉黃酮對慢性腦缺血大鼠腦內(nèi)NMDA受體和VEGF表達(dá)的影響〔J〕.中國病理生理雜志，2012;28(2):353-7.

2 韋登明，賈學(xué)敏，尹向旭，等.電針改善血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶及其與海馬神經(jīng)細(xì)胞谷氨酸、NMDAR表達(dá)的關(guān)系〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2011;31(19):3738-40.

3 劉曉華，沈梅紅，項(xiàng)曉人，等.電針對腦缺血再灌注模型大鼠海馬NMDA受體2A、2B亞型表達(dá)的影響〔J〕.遼寧中醫(yī)雜志，2011;38(10):2080-2.

4 陳澤斌，鄒 峰，袁 芳，等.針刺預(yù)處理對腦缺血再灌注大鼠頂皮質(zhì)NR2A和NR2B蛋白表達(dá)的影響〔J〕.中國中西醫(yī)結(jié)合急救雜志，2005;12(2):79-83.

5 沈梅紅，李忠仁，項(xiàng)曉人，等.電針對腦缺血再灌注大鼠大腦皮層超微結(jié)構(gòu)的影響〔J〕.針刺研究，2009;34(3):167-70.

6 Pais TF，F(xiàn)igueiredo C，Peixoto R，et al.Necrotic neurons enhance microglial neurotoxicity through induction of glutami-nase by a MyD88-dependent pathway〔J〕.Neuroinflammation，2008;5(1):43.

7 Pei DS，Wang XT，Liu Y，et al.Neuroprotection against ischaemic brain injury by a GluR6-9c peptide containing the TAT protein transduction sequence〔J〕.Brain，2006;129(2):465-79.

8 Prybylowski K，Wenthold RJ.N-Methyl-D-aspartate receptors:sub unit assembly and trafficking to the synapse〔J〕.J Biol Chem，2004;279(11):9673-6.

9 Liu Y，Wong TP，Michelle Aarts.NMDA receptor subunits have differential roles in mediating excitotoxic neuronal death both in vitro and in vivo〔J〕.J Neurosci，2007;27(11):2846-57.

10 徐鐵軍，樊紅彬，張鳳真，等.前腦缺血再灌流后大鼠海馬NMDA受體亞單位NR2A和NR2B蛋白質(zhì)表達(dá)的變化〔J〕.神經(jīng)解剖學(xué)雜志，2004;18(2):110-6.