趙永勛 李玉民 關(guān)泉林 趙 鵬 韓 儉 曹 農(nóng) 馮 穎
(蘭州大學(xué)第一醫(yī)院腫瘤外科,甘肅 蘭州 730000)
Runx3基因是一種新發(fā)現(xiàn)的定位于染色體1p36的抑癌基因,在細胞生長發(fā)育過程中起重要作用,Runx3表達缺失與胃癌發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切〔1〕。誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)是重要的炎癥因子,其所產(chǎn)生的一氧化氮(NO)在胃癌發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用〔2〕。流行病學(xué)調(diào)查顯示,胃癌的發(fā)生與幽門螺桿菌(HP)感染密切相關(guān)〔3〕。Katayama等〔4〕最近研究發(fā)現(xiàn),HP 誘導(dǎo)巨噬細胞產(chǎn)生NO,NO引起胃上皮細胞Runx3甲基化發(fā)生,這種甲基化作用能夠被特異性的iNOS抑制劑所逆轉(zhuǎn),HP通過NO介導(dǎo)誘導(dǎo)Runx3甲基化發(fā)生,導(dǎo)致Runx3蛋白低表達,從而導(dǎo)致胃癌發(fā)生,NO在此過程中發(fā)揮中樞角色。本研究對胃癌組織中Runx3、iNOS蛋白表達和HP感染進行檢測,探討它們之間的相關(guān)性及與胃癌臨床病理特征、患者生存之間的關(guān)系。
1.1 材料 收集蘭州大學(xué)第一醫(yī)院腫瘤外科2004年6月至2005年12月86例病理確診的原發(fā)性胃癌組織及相應(yīng)的癌旁組織(距癌灶邊緣>5 cm,病理證實為非腫瘤組織)標(biāo)本,病例均經(jīng)術(shù)前內(nèi)鏡活檢病理確診,術(shù)后組織標(biāo)本均經(jīng)石蠟切片病理診斷證實,術(shù)前均未行放療或化療。男性52例,女性34例,平均年齡52(28~78)歲。組織分化程度:高中分化48例,低分化38例。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移54例,無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移32例。浸潤深度:浸潤黏膜層9例,浸潤肌層36例,浸潤漿膜層29例,浸潤漿膜外及遠處12例。除ⅠA期之外其余患者術(shù)后均給予5-Fu為主4個周期全身靜脈化療。全部患者由本科隨訪室專人跟蹤隨訪,具有完整的隨訪資料,均自手術(shù)日計生存和隨訪時間,至患者死亡或截止時間2009年6月,全部病例術(shù)后隨訪3~60個月。20例健康對照選自我院消化內(nèi)科門診同期排除腫瘤和消化系統(tǒng)疾病的健康體檢者胃黏膜(胃鏡取材)作為健康對照組,其中男性12例,女性8例,平均年齡49歲,取胃竇部黏膜組織3塊,1塊行快速尿素酶試驗,1塊速凍保存,1塊石蠟包埋。
1.2 方法
1.2.1 HP感染檢測 所有患者術(shù)前胃鏡活檢時行快速尿素酶診斷法檢測HP感染狀況(福建三強公司試劑盒),加入活檢組織樣本后黃色試紙1 min內(nèi)變?yōu)闄鸭t色為HP(+);石蠟包埋標(biāo)本行Warthin-Starry染色法檢測HP感染狀況,HP呈棕褐色彎曲短桿狀,散在或成堆分布為陽性,無HP檢出者為陰性;二者均陽性為HP感染。
1.2.2 免疫組化SP法檢測 兔抗人多克隆Runx3抗體(北京博奧森公司),兔抗人多克隆iNOS抗體(北京中杉公司),免疫組化SP試劑盒和DAB顯色試劑盒(福州邁新公司)。組織標(biāo)本離體后30 min內(nèi)以10%甲醛溶液固定24 h,常規(guī)石蠟包埋,4 μm厚的切片,切片經(jīng)脫蠟、酒精水化、微波抗原熱修復(fù);3%過氧化氫阻斷后,滴加稀釋的一抗Runx3抗體(1∶100)、iNOS抗體(1∶50),4℃過夜后加二抗,DAB顯色,蘇木素復(fù)染,封片。用已知胃癌陽性作為陽性對照,用PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照。
1.2.3 結(jié)果判定 在臨床病理資料雙盲的條件下,分別由二位病理醫(yī)師記數(shù)陽性染色細胞所占比例,獨立判定結(jié)果,最后討論核實確認。Runx3陽性表達為細胞核或細胞質(zhì)染成黃色或棕黃色顆粒,iNOS的陽性表達為細胞質(zhì)染成黃色或棕黃色顆粒;將切片中陽性細胞數(shù)<10%記為陰性,≥10%記為陽性。
1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件,計數(shù)資料的比較采用χ2檢驗,相關(guān)分析采用Spearman相關(guān)分析,生存率的計算和比較使用Kaplan-Meier限乘法和Log-rank檢驗。
2.1 Runx3蛋白、iNOS蛋白在胃組織中的表達 Runx3陽性表達為細胞核或細胞質(zhì)染成黃色或棕黃色顆粒,iNOS的陽性表達為細胞質(zhì)染成黃色或棕黃色顆粒。在20例正常對照組織中,Runx3、iNOS蛋白的陽性表達率分別為100.00%(20/20)、10.00%(2/20),86例癌旁組織中Runx3、iNOS蛋白的陽性表達率分別為89.53%(77/86)、16.28%(14/86),86例胃癌組織中Runx3、iNOS蛋白的陽性表達率分別為43.02%(37/86)、72.09%(62/86),Runx3、iNOS蛋白陽性表達胃癌組織與正常對照組織、癌旁組織差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),癌旁組織與正常對照組織差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖1)。
圖1 胃癌組織Runx3和iNOS蛋白表達(SP,×400)
2.2 Runx3、iNOS蛋白陽性表達與胃癌臨床病理特征的關(guān)系
Runx3蛋白陽性表達在腫瘤組織分化差(χ2=5.503,P=0.019)、浸潤較深(χ2=6.048,P=0.014)、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(χ2=4.614,P=0.032)的胃癌組織中表達缺失更明顯,而與患者年齡、性別等臨床病理特征無關(guān)(P>0.05);iNOS蛋白陽性表達隨腫瘤浸潤加深(χ2=4.571,P=0.033)、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(χ2=9.114,P=0.003)在胃癌組織中表達顯著升高,而與患者年齡、性別及腫瘤組織分化等臨床病理特征無關(guān)(P>0.05)(表1)。
2.3 胃癌患者和正常對照HP感染的檢測 健康對照組HP感染率40.0%(8/20),胃癌組明顯升高達67.4%(58/86)(χ2=5.201,P=0.023)。
2.4 胃癌Runx3蛋白、iNOS蛋白表達與HP感染的關(guān)系 86例胃癌患者中HP感染組Runx3蛋白陽性表達率為31.0%(18/58),HP非感染組Runx3蛋白陽性表達率為67.9%(19/28)(χ2=10.445,P=0.001);iNOS蛋白在 HP感染組陽性表達率為100%(58/58),在HP非感染組iNOS蛋白陽性表達率為14.3%(4/28)(χ2=68.959,P <0.001)。提示胃癌中 HP 感染升高iNOS蛋白表達,但卻降低Runx3蛋白表達,HP感染影響胃癌Runx3、iNOS蛋白表達。
2.5 胃癌Runx3蛋白和iNOS蛋白表達的相關(guān)性 86例胃癌中Runx3蛋白和iNOS蛋白同為陽性者20例,同為陰性者7例,兩者表達之間存在顯著負相關(guān)(r=-0.349,P<0.01)。
2.6 Runx3蛋白表達與胃癌患者生存率的關(guān)系 Kaplan-Meier生存曲線提示Runx3蛋白陰性表達組患者3年和5年生存率分別為45.1%和32.6%,Runx3蛋白陽性表達組患者分別為69.6%和60.9%,Log-rank檢驗提示Runx3蛋白陰性表達組患者生存率明顯低于Runx3蛋白陽性表達組患者的生存率,胃癌組織中Runx3蛋白表達與患者生存率顯著相關(guān)(χ2=7.361,P=0.007)。
2.7 iNOS蛋白表達與胃癌患者生存率的關(guān)系 Kaplan-Meier生存曲線提示iNOS蛋白陽性表達組患者3年和5年生存率分別為52.2%和42.9%,iNOS蛋白陰性表達組患者分別為65.5%和51.4%,Log-rank檢驗提示iNOS蛋白表達與患者生存無關(guān),胃癌組織中iNOS蛋白表達與患者生存率無關(guān)(χ2=1.136,P=0.286)。
表1 胃癌Runx3蛋白、iNOS蛋白表達與臨床病理特征的關(guān)系〔n(%)〕
Li等〔1〕研究發(fā)現(xiàn)有45% ~60%人胃癌細胞中有Runx3蛋白表達下降或缺失,Runx3基因敲除小鼠的胃黏膜上皮細胞對TGF-β誘導(dǎo)的細胞凋亡產(chǎn)生拮抗效應(yīng),提示Runx3蛋白表達缺失,使胃黏膜上皮細胞凋亡受到抑制,從而引起胃黏膜過度增生,Runx3蛋白對胃黏膜上皮細胞的生長和分化均具有重要調(diào)控作用。Ito等〔5〕應(yīng)用免疫組化方法檢測了97例胃癌標(biāo)本和21株胃癌細胞株,表明Runx3蛋白表達與胃癌密切相關(guān)。本研究提示Runx3蛋白表達下調(diào)可能與胃癌的發(fā)生有關(guān)。Hsu等〔6〕研究也表明,39%(37/95)的胃癌Runx3蛋白表達缺失,Runx3蛋白表達和胃癌組織分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Runx3蛋白參與TGF-β信號傳導(dǎo)通路,與細胞分化、周期調(diào)控、凋亡和惡性轉(zhuǎn)化有關(guān)〔1〕,Runx3蛋白表達缺失,引起TGF-β信號傳導(dǎo)通路調(diào)節(jié)紊亂,參與胃癌的發(fā)生發(fā)展。
iNOS主要由腫瘤細胞和巨噬細胞在機體病理過程中產(chǎn)生,在正常組織不表達,一旦表達則持續(xù)催化產(chǎn)生大量NO。研究發(fā)現(xiàn)NO的生物學(xué)作用廣泛,主要通過激活癌基因/抑制抑癌基因、抗凋亡/促增殖、促腫瘤血管生成、促腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移、抑制宿主免疫等各種途徑參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移等過程〔7〕。目前已在多種腫瘤組織中檢測到iNOS的表達明顯高于正常組織,并與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)。Feng等〔8〕報道,胃癌組織中iNOS蛋白表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),iNOS蛋白表達的增加參與了胃癌的發(fā)生與浸潤。本研究提示iNOS蛋白表達升高可能與胃癌的發(fā)生有關(guān)。Wang等〔9〕研究表明iNOS蛋白表達與胃癌形成密切相關(guān),結(jié)果提示iNOS可能參與了胃黏膜癌變形成的整個過程,是胃癌發(fā)生發(fā)展轉(zhuǎn)移中的危險因素之一。
HP感染可能促進胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移〔10〕。本研究顯示持續(xù)HP感染可使胃黏膜病變逐漸加重,從而使胃癌發(fā)病的危險性增高,胃癌中HP感染升高iNOS蛋白表達,但卻降低Runx3蛋白表達,HP感染影響胃癌Runx3、iNOS蛋白表達。HP產(chǎn)生的細胞毒素能刺激炎癥細胞活化iNOS,有報道HP感染患者胃黏膜iNOS表達增加,而根除HP或加用抗氧化作用藥物以后iNOS明顯下降,導(dǎo)致iNOS激活的機制可能是HP感染后,炎癥細胞產(chǎn)生的炎癥介質(zhì)是iNOS的激動劑〔11〕。而且胃癌中Runx3蛋白和iNOS蛋白表達之間存在顯著負相關(guān)(r=-0.349,P<0.01)。Katayama等〔4〕最近通過胃上皮細胞和巨噬細胞共同培養(yǎng)的方法進行研究發(fā)現(xiàn),HP誘導(dǎo)巨噬細胞產(chǎn)生NO,NO引起胃上皮細胞Runx3甲基化發(fā)生,這種甲基化作用能夠被特異性的iNOS抑制劑所逆轉(zhuǎn),HP通過NO介導(dǎo)誘導(dǎo)Runx3甲基化發(fā)生,NO在此過程中發(fā)揮中樞角色,Runx3甲基化發(fā)生導(dǎo)致蛋白低表達或缺失。結(jié)果初步表明iNOS蛋白在HP感染影響Runx3蛋白表達中發(fā)揮重要的作用,胃癌發(fā)生中幽門螺桿菌感染是通過NO介導(dǎo)對Runx3基因表達進行調(diào)節(jié)。
本研究顯示胃癌組織中Runx3蛋白表達與患者生存率顯著相關(guān),iNOS蛋白表達與胃癌患者生存率無關(guān)。已有研究顯示Runx3蛋白與胃癌患者的不良預(yù)后密切相關(guān)〔6,12〕。Araki等〔13〕在對98例肺腺癌患者5年生存率的研究中也得出相同的結(jié)論。本研究顯示iNOS蛋白表達可能發(fā)生于胃黏膜癌變形成的整個過程,在胃癌發(fā)展病程中起促癌作用。而正是因為在HP感染誘發(fā)iNOS蛋白表達的促癌作用下,通過甲基化作用而導(dǎo)致Runx3蛋白低表達或缺失,Runx3蛋白表達在胃癌發(fā)生發(fā)展、浸潤轉(zhuǎn)移及預(yù)后病程中起關(guān)鍵性作用。因此如本研究所示,胃癌患者預(yù)后不良與Runx3蛋白表達有關(guān),而與iNOS蛋白表達無關(guān),通過檢測胃癌組織中Runx3蛋白的表達可作為預(yù)測胃癌患者預(yù)后一個良好的分子標(biāo)志物,并可指導(dǎo)臨床選擇合理的治療方案。
HP感染可以作為胃癌的啟動因子,HP感染是通過NO介導(dǎo)對Runx3基因表達進行調(diào)節(jié)而參與胃癌的發(fā)生、發(fā)展,從基因水平闡明了胃癌發(fā)病新的分子機制。iNOS蛋白在胃癌發(fā)生發(fā)展中起促癌作用,與起關(guān)鍵性作用的Runx3蛋白起協(xié)同作用。治療HP感染、干預(yù)iNOS蛋白表達可達到對胃癌預(yù)防的效果,通過誘導(dǎo)Runx3蛋白重新表達,可以為胃癌基因治療提供新的靶點。
1 Li QL,Ito K,Sakakura C,et al.Causal relationship between the loss of RUNX3 expression and gastric cancer〔J〕.Cell,2002;109(1):113-24.
2 Catalano V,Graziano F,Santini D,et al.Second-line chemotherapy for patients with advanced gastric cancer:who may benefit〔J〕?Br J Cancer,2008;99(9):1402-7.
3 Rozen P.Cancer of the gastrointestinal tract:early detection or early prevention〔J〕?Eur J Cancer Prev,2004;13(1):71-5.
4 Katayama Y,Takahashi M,Kuwayama H.Helicobacter pylori causes runx3 gene methylation and its loss of expression in gastric epithelial cells,which is mediated by nitric oxide produced by macrophages〔J〕.Biochem Biophys Res Commun,2009;388(3):496-500.
5 Ito K,Liu Q,Salto-Tellez M,et al.RUNX3,a novel tumor suppressor,is frequently inactivated in gastric cancer by protein mislocalization〔J〕.Cancer Res,2005;65(6):7743-50.
6 Hsu PI,Hsieh HL,Lee J,et al.Loss of Runx3 expression correlates with differentiation,nodal metastasis,and poor prognosis of gastric cancer〔J〕.Ann Surg Oncol,2009;16(6):1686-94.
7 徐梅華.一氧化氮、一氧化氮合成酶與結(jié)直腸腫瘤〔J〕.國外醫(yī)學(xué)·消化系疾病分冊,2002;22(3):161-3.
8 Feng CW,Wang LD,Jiao LH,et al.Expression of p53,inducible nitric oxidesynthase and vascular endothelial growth factor in gastric precancerous and cancerous lesions:correlationship with clinical features〔J〕.BMC Cancer,2002;29(1):8-14.
9 Wang GY,Ji B,Wang X,et al.Anti-cancer effect of iNOS inhibitor and its correlation with angiogenesis in gastric cancer〔J〕.World J Gastroenterol,2005;11(25):3830-3.
10 郭曉林,姜雅秋,王 丹.幽門螺桿菌感染與C-myc基因和P53基因表達與胃癌的相關(guān)性研究〔J〕.中國老年學(xué)雜志,2007;27(1):56-8.
11 Connelly ST,Macabeo-ong M,Dekker N,et al.Increased nitric oxide levels and iNOS over-expression in oral squamous cell carcinoma〔J〕.Oral Oncol,2005;32(3):261-7.
12 Wei D,Gong W,Oh SC,et al.Loss of RUNX3 expression significantly affects the clinical outcome of gastric cancer patients and its restoration causes drastic suppression of tumor growth and metastasis〔J〕.Cancer Res,2005;65(11):4809-16.
13 Araki K,Osaki M,Nagahama Y,et al.Expression of RUNX3 protein in human lung adenocarcinoma:implications for tumor progression and prognosis〔J〕.Cancer Sci,2005;96(4):227-31.