龐耀珊，謝芝勛，鄧顯文，謝志勤，謝麗基，劉加波，范 晴

（廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所/廣西畜禽疫苗新技術(shù)重點(diǎn)實驗室，廣西南寧 530001）

禽流感病毒（Avian inf l uenza virus， AIV）屬于A型流感病毒，能廣泛感染包括鳥類和哺乳動物在內(nèi)多種動物發(fā)生嚴(yán)重疾病綜合癥[1-11]。至今為止，已發(fā)現(xiàn)了16個血凝素（HA）和9個神經(jīng)氨酸酶（NA）亞型[12-13]。不同亞型之間禽流感病毒的致病性是不同的。其中，H5亞型為高致病性亞型，歷史上多起與H5亞型相關(guān)的禽流感疫情爆發(fā)，除了造成禽類大規(guī)模死亡外，對人畜也造成了不同程度的威脅。特別是近年來在亞洲地區(qū)爆發(fā)的H5N1亞型禽流感，在肆虐該地區(qū)養(yǎng)禽業(yè)的同時，也引發(fā)了多起人畜感染發(fā)病、甚至死亡的事件 ，凸現(xiàn)了該病的重要公共衛(wèi)生意義[2-6]。AIV是一種極易傳播的病原，感染禽類的流動及其與其它動物密切接觸是禽流感傳播的一個重要因素[14-17]。研究開發(fā)有效的診斷試劑和診斷技術(shù)對該病的有效防控具有重要意義[18-22]。

研究表明，HA蛋白是AIV最主要的表面抗原糖蛋白，與病毒的抗原性和致病性直接相關(guān)[23-24]，在AIV的病原學(xué)診斷和血清學(xué)診斷中扮演著重要角色[19-22，25]。

在AIV單克隆抗體制備技術(shù)中，免疫抗原主要包括以下3大類：純化病毒、病毒亞單位及重組表達(dá)蛋白[25-31]。純化病毒和病毒亞單位作為抗原制備單克隆抗體時，需要涉及病毒培養(yǎng)、滅活和純化等過程。特別是H5亞型AIV是一種高致病性亞型，具有潛在的生物安全危害，需要在授權(quán)的特定實驗室并在特殊條件下才能生產(chǎn)，抗原來源受到嚴(yán)格控制，在一定程度上限制了該病診斷技術(shù)研究的進(jìn)程。為此，十分有必要探索一條安全可靠的抗原制備及診斷試劑開發(fā)途徑，為相關(guān)診斷技術(shù)的研究開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

抗原表位又稱抗原決定簇（antigenic determinant，AD），是抗原物質(zhì)中激活淋巴細(xì)胞，引起機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng)的主要結(jié)構(gòu)，它決定著抗原的特異性。為了解決H5亞型AIV抗原及其單克隆抗體生產(chǎn)難題，本研究擬利用H5N1亞型禽流感病毒的HA抗原表位重組表達(dá)蛋白為免疫抗原，通過雜交、篩選，獲取針對該抗原表位的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，并對該細(xì)胞株所生產(chǎn)的單克隆抗體的主要特性及其可用性進(jìn)行初步研究。為H5亞型AIV抗原制備及單克隆抗體制備探索的一條安全可靠的途徑，打破該病檢測技術(shù)研究開發(fā)的瓶頸，對H5亞型禽流感的防控有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試驗條件

1.1.1 重組表達(dá)質(zhì)粒陽性重組菌 H5亞型禽流感病毒HA抗原表位重組表達(dá)質(zhì)粒陽性重組菌Rosetta-gami B （DE3）/pET-32a（+）-HA，本實驗室構(gòu)建并保存，該重組菌誘導(dǎo)表達(dá)的目的蛋白大小為48.1kD。

1.1.2 試驗動物與細(xì)胞 12只8～10周齡健康BALB/c鼠，購自廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心；骨髓瘤細(xì)胞株SP2/0，由美國賓夕法尼亞州州立大學(xué)動物診斷中心Dr. Lu惠贈，本實驗室保存。

1.1.3 主要藥品試劑 福氏完全佐劑及不完全佐劑、改良RPMI-1640培養(yǎng)基及DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS），GIBCO公司產(chǎn)品；氨基蝶呤（Aminopterin）、次黃嘌呤（Hypoxanthine）、胸腺嘧啶核苷（Thymidine）、PEG-1000，Sigma公司產(chǎn)品，分別配制成含氨基蝶呤4×10-5mol/L的A儲存液、含次黃嘌呤1×10-2mol/L和含胸腺嘧啶核苷1.6×10-3mol/L的HT儲存液、50%PEG儲存液，-20℃保存。羊抗鼠免疫球蛋白亞類分型試劑盒（SBA Cloningtyping System/HRP），購自SouthernBiotech公司；HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG及羊抗雞IgG，購自KPL公司。H5N1標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和SPF陰性雞血清，購自哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司。BCA蛋白濃度測定試劑盒，購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

他爸臉色精彩極了，我媽的表情更精彩，巴掌再次拍拍落在我身上，我捂著屁股亂叫，一人做事一人當(dāng)，你們懂個屁。

1.1.4 試驗儀器 KHB ST-360酶標(biāo)儀，上海科華實驗系統(tǒng)有限公司產(chǎn)品。

1.2 設(shè)計思路 利用本實驗室前期構(gòu)建的H5亞型AIV HA抗原表位重組表達(dá)質(zhì)粒陽性重組菌Rosettagami B （DE3）/pET-32a（+）-HA在體外進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，獲得重組蛋白包涵體。利用重組蛋白上組氨酸標(biāo)簽對包涵體蛋白進(jìn)行純化。純化蛋白與福氏佐劑混合制備成抗原，免疫8～10周齡健康BALB/c鼠。多次免疫后，取小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，獲得雜交瘤細(xì)胞株。以純化重組表達(dá)蛋白為抗原建立間接ELISA，并用該方法對雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行多次篩選，得到分泌相應(yīng)單克隆抗體的細(xì)胞株。利用有限稀釋法對單克隆細(xì)胞株進(jìn)行亞克隆，獲得純化的單克隆細(xì)胞株。擴(kuò)大培養(yǎng)陽性的單克隆細(xì)胞株，腹腔注射小鼠3只生產(chǎn)腹水。分別測定單克隆抗體的效價及其基本特性，最后通過免疫阻斷試驗評估該單克隆抗體的實際應(yīng)用價值。

1.3 試驗方法

1.3.1 HA抗原表位重組蛋白的制備及純化 將含有H5亞型禽流感病毒HA抗原表位重組表達(dá)質(zhì)粒陽性重組菌Rosetta-gami B（DE3）/pET-32a（+）-HA接種到5 mL含50 μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)過夜，再按10%的接種量接種到500 mL含50 μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、150 r/min振搖培養(yǎng)至對數(shù)生長期，用紫外分光光度計測定菌液的OD600吸光值，當(dāng)吸光值達(dá)到0.5～0.8之間的任何一個值時，加入終濃度為1 mmol/L的異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)劑，繼續(xù)在37 ℃、150 r/min振搖培養(yǎng)過夜，獲得細(xì)菌懸液，2500×g離心10 min，收集菌體沉淀。用10 mL的PBS溶液重懸，取5μL菌體懸液按常規(guī)方法進(jìn)行SDS-PAGE電泳，檢測表達(dá)結(jié)果（目的重組蛋白大小約48.1 kD）；其余懸液加入終濃度為100 μg/mL的溶菌酶，在冰上進(jìn)行超聲波裂解，10000×g離心5 min收集包涵體沉淀。利用QIAexpress Ni-NTA Fast Sart His標(biāo)簽重組蛋白純化試劑盒，按說明對His標(biāo)簽重組蛋白進(jìn)行純化，純化產(chǎn)物置-70 ℃保存?zhèn)溆?。? μL純化產(chǎn)物按常規(guī)方法進(jìn)行SDS-PAGE電泳和WesternBlot，并用H5N1標(biāo)準(zhǔn)陽性雞血清和SPF陰性雞血清進(jìn)行驗證。

1.3.2 單克隆抗體檢測方法的建立 用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定純化蛋白的濃度，參考秦春香[32]方法，根據(jù)ELISA技術(shù)原理，利用方陣試驗，將重組蛋白稀釋成不同濃度包被ELISA板，測定小鼠陽性血清的OD450吸光值。

1.3.3 雜交瘤細(xì)胞株的建立

1.3.3.1 小鼠免疫 加入福氏完全佐劑制備成200 μg/mL的免疫抗原，參考文獻(xiàn)[25，31]方法，皮下分點(diǎn)注射8-10周齡健康BALB/c鼠，0.5 mL/只。以后每隔14天，用福氏不完全佐劑制備的抗原再免疫2次。細(xì)胞融合前3天通過腹腔注射加強(qiáng)免疫一次。

1.3.3.2 細(xì)胞融合及篩選 參考文獻(xiàn)[31]，無菌剖殺小鼠，制備脾細(xì)胞懸液，利用PEG融合試劑將脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進(jìn)行融合。融合10天后，收集雜交瘤細(xì)胞上清液，以SP2/0細(xì)胞上清液和免疫小鼠陽性血清分別作陰性和陽性對照，用所建立的HA抗原表位重組蛋白ELISA檢測方法雜交瘤細(xì)胞上清液進(jìn)行鑒定。利用有限稀釋法對陽性克隆進(jìn)行多次傳代純化，直到得到穩(wěn)定的陽性雜交瘤細(xì)胞株，液氮保存。

1.4 單克隆抗體的制備 將得到的雜交瘤細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)，制備成5×106個/mL細(xì)胞懸液。參考文獻(xiàn)[31]方法，先提前1天對9只8～10周齡健康BALB/c小鼠腹腔注射福氏不完全佐劑，劑量為0.1 mL/鼠，1天后再通過小鼠腹腔注射上述新鮮制備的雜交瘤細(xì)胞懸液1 mL/鼠。注射后每天觀察小鼠腹腔變化，待小鼠腹部明顯膨大后，剖腹采集腹水，10000×g離心3 min，收集上清，用間接ELISA方法測定腹水的單克隆抗體效價，-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 單克隆抗體特性鑒定

1.5.1 Ig亞類鑒定 收集陽性雜交瘤細(xì)胞上清液，利用羊抗鼠免疫球蛋白亞類分型試劑盒（SBA Cloningtyping System/HRP），按試劑盒說明對陽性雜交瘤細(xì)胞所分泌的單克隆抗體Ig類型和輕鏈類型進(jìn)行分型鑒定。

1.5.2 雜交瘤細(xì)胞穩(wěn)定性測定 凍存的雜交瘤細(xì)胞在液氮中凍存3個月和6個月后進(jìn)行復(fù)蘇，分別連續(xù)傳5代，收集細(xì)胞上清液，用本研究所建立的間接ELISA檢測方法進(jìn)行測定。

1.5.3 單克隆抗體特異性測定 腹水單克隆抗體稀釋2000倍后分別與固定于硝酸纖維素膜上的H5、H7、H9亞型禽流感病毒陽性抗原、新城疫病毒（NDV）陽性抗原、傳染性支氣管炎病毒（IBV）陽性抗原、產(chǎn)蛋下降綜合癥病毒（EDS）陽性抗原按常規(guī)方法進(jìn)行WesternBlot免疫印跡試驗，同時以SP2/0細(xì)胞上清、未免疫小鼠陰性血清、SPF雞血清作陰性對照，陽性鼠血清和H5N1陽性雞血清作陽性對照，檢測單克隆抗體的特異性。

1.6 免疫阻斷試驗 用辣根過氧化酶（HRP）標(biāo)記腹水單克隆抗體，將H5N1亞型禽流感病毒陽性雞血清稀釋100倍后，加入到1.5方法中建立的HA抗原表位重組表達(dá)蛋白包被的ELISA板中，37 ℃作用1 h，再加入1×104倍稀釋的HRP標(biāo)記的腹水單克隆抗體，37 ℃作用30 min，顯色后用酶標(biāo)儀測定樣品的OD450吸光值。試驗同時用SPF雞血清代替H5N1亞型禽流感病毒陽性雞血清作陰性對照。每份樣品重復(fù)測試3次。根據(jù)公式X+3STD計算出陽性判定值，公式中的X為陰性對照樣品OD450的平均值，STD為陰性對照樣品方差。當(dāng)待檢樣品的OD450平均值≤陽性判定值時，判定待檢樣品阻斷陽性，反之為陰性。

2 結(jié)果

2.1 HA抗原表位重組蛋白的制備及純化結(jié)果 含有H5亞型禽流感病毒HA抗原表位重組表達(dá)質(zhì)粒陽性重組菌Rosetta-gami B（DE3）/pET-32a（+）-HA經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，SDS-PAGE檢測結(jié)果如圖1所示，在48.1 kD處出現(xiàn)豐度較高的重組表達(dá)蛋白，重組蛋白包涵體經(jīng)his標(biāo)簽純化后能與H5N1標(biāo)準(zhǔn)陽性雞血清起特異性反應(yīng)，與SPF陰性雞血清無反應(yīng)，見圖2 WesternBlot免疫印跡結(jié)果。

2.2 單克隆抗體檢測方法的建立結(jié)果 以不同濃度的純化重組蛋白為抗原包被ELISA板，通過方陣試驗測試，建立了以15 μg/mL蛋白濃度為包被抗原的H5亞型禽流感病毒HA抗原表位單克隆抗體的間接ELISA檢測方法。

2.3 雜交瘤細(xì)胞株的建立結(jié)果 多次免疫的BALB/c鼠脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合后，經(jīng)間接ELISA檢測篩選，獲得1株能穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。雜交瘤細(xì)胞株多次克隆純化后，命名為W2-2。

2.4 單克隆抗體的制備結(jié)果 W2-2細(xì)胞株腹腔注射小鼠后，小鼠于第10天左右腹部明顯膨大，平均每只小鼠采集到約8 mL腹水。經(jīng)測定，離心處理后的腹水上清單克隆抗體的ELISA效價達(dá)1:5×104。

2.5 單克隆抗體特性鑒定結(jié)果

2.5.1 Ig亞類鑒定結(jié)果 經(jīng)鑒定，雜交瘤細(xì)胞株所分泌的單克隆抗體亞類為IgM、輕鏈類型為IgK亞類。

2.5.2 雜交瘤細(xì)胞穩(wěn)定性測定結(jié)果 在液氮中凍存了3個月和6個月后的雜交瘤細(xì)胞復(fù)蘇后，經(jīng)本研究所建立的間接ELISA檢測方法測定，其傳代細(xì)胞仍能穩(wěn)定分泌特定單克隆抗體。

2.5.3 單克隆抗體特異性測定結(jié)果 腹水單克隆抗體稀釋2000倍后與不同禽病抗原WesternBlot免疫印跡結(jié)果如表1及圖3所示。從表1中結(jié)果可見，本研究所制備的單克隆抗體只與H5亞型禽流感病毒陽性抗原起反應(yīng)，與供試的其它禽病陽性抗原無反應(yīng)，結(jié)果與小鼠陽性血清及雞H5N1血清試驗結(jié)果一致；SP2/0細(xì)胞上清、未免疫小鼠陰性血清、SPF雞血清與供試的上述各種抗原均無反應(yīng)。

表1 單克隆抗體特異性鑒定結(jié)果

2.6 免疫阻斷試驗結(jié)果 結(jié)果如表2所示，SPF陰性血清100倍稀釋后，3次重復(fù)試驗的OD450平均值為0.252，STD值為0.033，根據(jù)公式X+3STD計算出其陽性判定值為0.352。H5N1禽流感病毒陽性雞血清100倍稀釋后所測得的3次重復(fù)試驗結(jié)果平均值為0.152，小于陽性判定值0.352，判定為阻斷試驗陽性。

表2 免疫阻斷試驗結(jié)果

3 討論

單克隆抗體是由B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合后形成的雜交瘤單克隆細(xì)胞分泌合成的針對一種特定抗原決定簇的抗體，具有來源方便、穩(wěn)定性高、均一性好、濃度高等優(yōu)點(diǎn)，可用作病原或血清學(xué)檢驗診斷試劑[25-31]。

H5N1禽流感病毒基因組由8個RNA節(jié)段組成，共編碼11種病毒蛋白，抗原成分復(fù)雜，所包含的抗原決定簇數(shù)量龐大。利用提純病毒免疫小鼠時，可能會得到針對各種抗原成份的單克隆抗體，給單克隆抗體的篩選帶來一定困難[28-30]。

本研究利用重組表達(dá)蛋白為抗原制備單克隆抗體，抗原來源方便，純化方法簡單，與純化病毒制備方法相比，更易于得到特定抗體種類單一的雜交瘤細(xì)胞株[30]。如圖2 WesternBlot免疫印跡結(jié)果和雜交瘤細(xì)胞株的建立結(jié)果所示，重組表達(dá)蛋白可以作為ELISA包被抗原直接對單克隆抗體進(jìn)行篩選，簡化了單克隆抗體的篩選工作。

本研究所建立的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，在液氮中保存3個月和6個月后再復(fù)蘇，經(jīng)多次傳代仍能穩(wěn)定分泌針對H5亞型AIV HA抗原表位蛋白的單克隆抗體，其ELISA效價高達(dá)1:5×104。WesternBlot免疫印跡試驗結(jié)果表明，本研究制備的單克隆抗體具有高度特異性。B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的抗體，根據(jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)和抗原的不同可以分為IgG、IgM、IgA、IgE和IgD 5種類型。資料表明[33-34]，IgM具有參與凝集反應(yīng)和補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)的特性。本研究所制備的單克隆抗體為具有IgK輕鏈的IgM亞類，提示這些單克隆抗體同樣具有凝集反應(yīng)和補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)活性，可以作為檢測試劑應(yīng)用于下一步相關(guān)檢測技術(shù)中。本研究的免疫阻斷試驗結(jié)果也初步驗證了這一推斷。

4 結(jié)論

本研究成功探索出一套利用H5亞型AIV HA抗原表位重組表達(dá)蛋白制備單克隆抗體的方法，該方法與純化病毒制備方法相比，更加簡便、高效，打破了H5亞型AIV檢測技術(shù)研究的局限性。

致謝：感謝美國賓夕法尼亞州州立大學(xué)動物診斷中心的Dr. Lu Hua-guang贈送的骨髓瘤細(xì)胞株SP2/0；感謝南寧市藍(lán)光生物技術(shù)有限公司的謝體三博士對本研究提供支持和幫助。

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