王瓊秋，劉伯庶

（紅河州動物疫病預(yù)防控制中心，云南蒙自 661100）

豬繁殖障礙綜合征是由不同病原微生物感染繁殖母豬和種公豬引起的，主要表現(xiàn)為母豬不孕、流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、弱仔和新生仔豬發(fā)育不良及公豬睪丸腫大、精液品質(zhì)差等癥狀。近年來，云南紅河州地區(qū)相繼出現(xiàn)了母豬不育、妊娠期流產(chǎn)、產(chǎn)死胎或產(chǎn)弱仔，公豬喪失種用能力等癥狀，該病的發(fā)生對養(yǎng)殖業(yè)和公共衛(wèi)生造成嚴重威脅。為弄清發(fā)病原因，制定出切實可行的防治措施，筆者于2000年提出并對該項目進行了系統(tǒng)的調(diào)查研究，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料和方法

1.1 細胞和培養(yǎng)基 豬腎傳代細胞SK-6、PK-193、PK-15細胞由云南省熱帶亞熱帶動物病毒重點實驗室（YTSAVDL）保存提供；MEM培養(yǎng)基GTBCO公司生產(chǎn)；新生犢牛血清，購自鄧川蝶泉牛奶公司。

1.2 參考病毒株和血清 PPV/A株、PRV/A株由YTSAVDL保存；中和試驗標準陽性血清、豚鼠陽性血清購自華農(nóng)中業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院；陰性血清采自健康豬經(jīng)中和試驗證實為PRV和PPV陰性；衣原體補體抗原和抗血清購于蘭州獸醫(yī)研究所。

1.3 主要試劑 小量柱式離心病毒/液體樣品中的DNA/RNA抽提試劑盒購于華舜生物工程（上海）公司；Premix Tag試劑購自寶生物工程（大連）有限公司，引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。

1.4 試驗動物 7日齡雞胚由YTSAVDL提供；健康大白兔（體重1.5～2.0 kg），健康成年妊娠豚鼠（1～1.5 kg）均由云南省生物制藥廠試驗動物中心提供。

1.5 流行病學(xué)調(diào)查和臨床及病理觀察 在紅河州種豬場，擴繁場，規(guī)模豬場及散養(yǎng)戶中開展流行病學(xué)調(diào)查和臨床及病理觀察。按照王瓊秋等（2007）[5]介紹的方法進行。

1.6 血清學(xué)調(diào)查 對1 187頭繁殖障礙母豬和種公豬采集血清，采用華中農(nóng)業(yè)大學(xué)提供的PPV和PRV乳膠凝集診斷試劑盒，北京愛德士元享生物制品有限責(zé)任公司生產(chǎn)PRRSV、CSF、 PCV試劑盒，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所生產(chǎn)的CP微量IHA診斷抗原及中國預(yù)防醫(yī)學(xué)院流行病研究所生產(chǎn)的Br虎紅平板抗原、試管凝集抗原及陰陽性血清進行檢測。上述試劑的檢測方法及判定標準按照試劑說明書的要求進行。

1.7 病料采集 采集28頭流產(chǎn)胎兒和死亡弱仔的腦、肝、腎、淋、肺等每份組織分別分裝于2個無菌瓶內(nèi)一份置4 ℃，另一份置-20 ℃低溫保存。

1.8 病原菌分離培養(yǎng) 將4 ℃保存的病料分別接種普通營養(yǎng)肉湯、營養(yǎng)瓊脂、鮮血瓊脂、胰蛋白胨培養(yǎng)基、厭氣肉肝湯培養(yǎng)基，37 ℃連續(xù)培養(yǎng)10 d，觀察生長情況。

1.9 雞胚接種 將-20 ℃凍存的36份病料取出按照王瓊秋等（2001）[4]介紹的方法進行接種。

1.10 病毒分離 參照殷震等（1997）[1]和《常見病毒病實驗技術(shù)》[2]及陳煥春等（1998）[3]介紹的方法進行病毒分離。

1.11 衣原體分離株鑒定 按照王瓊秋等（2001）[4]介紹的方法進行鑒定。

1.12 PRV和PPV毒株鑒定 毒價（TCID50）測定采用微量法按參考文獻[2-3]介紹方法進行，中和試驗采用固定病毒稀釋血清法，按參考文獻[2-3]介紹方法進行。

1.13 PCR檢測 PCR檢測由云南省熱帶亞熱帶動物病毒重點實驗室協(xié)助完成。

1.14 人工感染試驗 CP豚鼠和大白兔感染試驗：按照王瓊秋等（2001）[4]介紹的方法進行。PRV家兔感染試驗：分別將PRV/HH06和PRV/HH092株分離培養(yǎng)的病毒懸液每組接種3只健康家兔，每只腹側(cè)皮下注射0.5 mL，另設(shè)健康家兔3只注射MEM培養(yǎng)液作為對照，在相同條件下飼養(yǎng)，觀察發(fā)病情況[4]。

1.15 免疫效果試驗 疫苗、免疫方法和劑量按王瓊秋等（2001）[5]介紹的方法進行。

2 結(jié)果

2.1 流行病學(xué)調(diào)查 對9個縣（市）及文山州廣南縣、9個鄉(xiāng)鎮(zhèn)、15個自然村、19個種豬場，987戶農(nóng)戶的3 560頭繁殖母豬和種公豬調(diào)查。100%的縣、鄉(xiāng)、村、種豬場和37.5%（370/987）豬發(fā)病。其中種公豬發(fā)病率占調(diào)查數(shù)23.77%（34/143），繁殖母豬發(fā)病率占調(diào)查數(shù)41.38%（1 414/3 417）；調(diào)查5 767胎次，發(fā)病胎次占調(diào)查數(shù)33.01%（1 904/5 767）；在5 767胎次中共產(chǎn)仔63 093頭，在出生時或在一周內(nèi)發(fā)病死亡占產(chǎn)仔數(shù)的19.94%（12 581/63 093）；在死亡仔豬或胎兒中，流產(chǎn)或早產(chǎn)胎兒占11.19%（1 409/12 581）、死胎占47.96%（6 034/12 581）、木乃伊占6.05%（762/12 581）、畸形占3.0%（378/12 581）、弱仔占31.78%（3 998/12 581）。

2.2 臨床癥狀及病理剖檢 觀察 19個種豬場、1 414頭能繁母豬和143頭種公豬。母豬的主要癥狀為受胎率降低、流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、木乃伊、產(chǎn)弱仔；流產(chǎn)胎兒多為死胎、畸形、干尸胎兒（木乃伊）及骨質(zhì)不全的腐敗胎兒等；種公豬睪丸腫大、血精、膿精。病理剖檢變化的共同特征是死亡胎兒皮下膠樣浸潤，頸部、背部及四肢皮下暗紅色淤血、出血，胸腔中有多量淡紅色積液，腦較軟膜和腦實質(zhì)彌漫性出血。

2.3 血清學(xué)調(diào)查 對12個縣（市）及文山州廣南縣22個鄉(xiāng)鎮(zhèn)、23個自然村、30個豬場、105戶農(nóng)戶飼養(yǎng)的1 187頭豬采集血清，進行血清學(xué)檢測。結(jié)果CSF陽性率為 1.1%（13/1 187））、PPV陽性率為43.91%（522/1 187）、 PRV陽性率為24.6%（292/1 187）、CP陽性率為36.98%（493/1 187）、PRRSV陽性率為11.5%（136/1 187）、PCV陽性率7.2%（86/1 187）、Br陽性率為2.44%（29/1 187）。其中單一感染占39.6%（470/1 187），混合感染35.6%（423/1 187）。

2.4 病原菌分離 采36份病料，連續(xù)培養(yǎng)10 d，均未分離到布氏桿菌，胎兒彎桿菌等致病菌。

2.5 衣原體分離 從所采集的36份病料中分離到2株衣原體（CP/HH03和CP/HH28），菌株盲傳3代后，能在96～120 h內(nèi)可規(guī)律致死雞胚，表現(xiàn)為卵黃囊膜充血，易剝離，胚體水腫并有出血點，用感染雞胚卵黃囊膜涂片、染色、鏡檢見多量衣原體始體和原體。

2.6 衣原體分離株的鑒定

2.6.1 形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果 鏡檢后可見多量寶石紅色的衣原體顆粒，同時可觀察到2種顆粒，一種為圓形或橢圓形顆粒，平均直徑805 nm，顏色暗紅色，此為始體，另一種顆粒較多，呈圓形，平均直徑460 nm，顏色鮮紅色，此為原體（圖1）。

2.6.2 血清學(xué)試驗 用2株分離株制備的抗原和高免血清分別與標準衣原體抗血清和抗原在補體結(jié)合試驗中發(fā)生交叉反應(yīng)，結(jié)果表明分離株與標準株有共同的抗原關(guān)系。

2.6.3 毒價測定 所分離的2個毒株對雞胚的毒價均為10-9EID50/0.4 mL。

2.6.4 SD敏感試驗 分離株對SD不敏感。

2.6.5 碘染色試驗 將卵黃囊膜制片后，經(jīng)碘染色鏡檢不顯色，結(jié)果為陰性反應(yīng)。

2.7 PRV和PPV分離與鑒定

2.7.1 PRV分離結(jié)果 病料接種RK-6細胞，將第2代再轉(zhuǎn)移到PK-15和PK-193，均產(chǎn)生典型CPE，并且與PRV/A株所致CPE相同。分離獲得兩株P(guān)RV病毒，分別命名為PRV/HH06和PRV/HH09株。

2.7.2 PPV分離結(jié)果 病料在SK-6上連續(xù)傳7代，從第3代開始出現(xiàn)規(guī)律性CPE。經(jīng)1:10倍和1:100倍稀釋的組織液，接種后48 h、72 h、96 h后細胞開始脫落。分離獲得兩株P(guān)PV病毒，分別命名為PPV/HH17、PPV/HH18株。

2.7.3 病毒的TCID50測定 接種48h后出現(xiàn)CPE，經(jīng)計TCID50PRV 2株毒株的毒價為10-7.3/0.1 mL；PPV2株毒株的毒價為10-6.8/0.1 mL。

2.7.4 中和試驗 （1）以 PRV/HH06的 200TCID50/0.1mL的病毒液，能被PRV/A株陽性血清（1:108）中和。用HH06株高免兔血清，與PRVA毒株進行中和試驗，結(jié)果PRVA毒株200TCID50/0.1mL株均能被HH06毒株高免血清（1:306）所中和。結(jié)果表明，它們之間具有共同的抗原性。（2）以PPV/HH17的200TCID50/0.1 mL的病毒液能被PPVA株陽性血清（1:128）中和。用HH17株免兔血清，與PPV/A毒株進行中和試驗，結(jié)果PPVA毒株200TCID50/0.1 mL株均能被HH17株高免血清免疫（1:256）所中和，結(jié)果表明，它們之間具有共同的抗原性。

2.8 PCR檢測結(jié)果 結(jié)果詳見圖2～4。

2.9 人工感染試驗結(jié)果

2.9.1 CP動物感染結(jié)果 實驗組豚鼠接種3天后出現(xiàn)體溫升高、食欲減少、精神沉郁，9天后查到衣原體IHA抗體，15天后發(fā)生流產(chǎn)；采集流產(chǎn)胎兒的體表覆蓋物和內(nèi)臟涂片、染色、鏡檢均見多量寶石紅色的衣原體顆粒；同時從內(nèi)臟實質(zhì)臟器中回收到衣原體，對照組3只無異常變化。

2.9.2 PRV動物感染結(jié)果 以所分離PRV病毒接種實驗組家兔家兔接種48～72 h后開始發(fā)病，體溫上升達40 ℃以上，食欲減退或廢絕，狂躁不安，頻頻用舌舔，用嘴撕咬注射部位及其周圍皮膚，致使皮膚脫毛潰爛、出血，頭、頸、背等處擦傷，口流清液，120 h后四肢麻痹，臥地不起，最后衰竭死亡。剖檢死亡家兔發(fā)現(xiàn)注射部位嚴重壞死；整個肺臟彌漫性出血點，肺尖葉有出血點；喉頭、氣管有出血點；腦膜出血；腎表面有出血點。對照組3只家兔無異常變化。

2.10 免疫效果 結(jié)果詳見表1～2。

表1 紅河州7個縣21個豬場免疫前后3年免疫效果觀察統(tǒng)計表

表2 紅河州免疫豬場與未免疫豬場免疫效果觀察對比情況

3 討論

豬繁殖障礙綜合征在云南省乃至全國都是嚴重危害養(yǎng)豬業(yè)的重要因素之一。本項目首次全面揭示了紅河州豬繁殖障礙性疫病的流行狀況和危害程度，查明了引起豬繁殖障礙的主要病原，為紅河州及全省預(yù)防和防治豬繁殖障礙綜合征提供了科學(xué)依據(jù)。本次調(diào)查結(jié)果表明，單一病原感染占檢測感染率的39.6%，混合感染占檢測感染率的35.6%，在混合感染中多為二重、也有三重感染。同時采集36份母豬流產(chǎn)胎兒經(jīng)病原分離獲得豬細小病毒（PPV）、偽狂犬病毒（PRV）和衣原體（CP）各2株病原，分離株經(jīng)人工感染試驗復(fù)制出與自然相同的癥狀，并對感染率最高的PPV、PRV和CP三種疫病，在21個種豬場推廣使用疫苗進行免疫預(yù)防。結(jié)果顯示：與免疫前相比，母豬受胎率從92.7%提高到99.5%；妊娠母豬發(fā)病率從31.43%下降到0.77%；初生乳豬發(fā)病死亡率率從24.9%下降到0.27%，大大提高了養(yǎng)殖場（戶）的經(jīng)濟效益。試驗結(jié)果更進一步說明了紅河州豬繁殖障礙綜合征病原不僅為單一感染，而混合感染是主要因素，因此在防治時，必須考慮到幾種病原因素[5]。

在調(diào)查中發(fā)現(xiàn)紅河州多數(shù)種豬場和規(guī)模養(yǎng)殖場無嚴格的防疫和管理制度，對豬繁殖障礙病的危害性缺乏了解，實施的免疫病種不是根據(jù)疫情實際相應(yīng)調(diào)整，多年來只注重豬瘟、豬肺疫等常規(guī)病種的免疫，未將豬繁殖障礙病的主要病種豬偽狂犬病、細小病毒病、衣原體病、乙型腦炎、繁殖與呼吸綜合征等納入基礎(chǔ)免疫程序。因此，應(yīng)建立嚴格的程序免疫，從源頭上有效控制疫病的發(fā)生。

據(jù)對紅河州9個縣（市）、3 417頭繁殖母豬調(diào)查，其中出現(xiàn)繁殖障礙母豬達1 414頭，占調(diào)查數(shù)的41.4%，按每頭豬每年飼養(yǎng)管理費500元計算，造成母豬的經(jīng)濟損失70.7萬元；在調(diào)查5 767胎妊娠母豬中，發(fā)生繁殖障礙1 904胎，占調(diào)查總數(shù)的33.01%，在5 767胎妊娠母豬中，共產(chǎn)仔63 093頭，因流產(chǎn)、產(chǎn)出死胎（包括木乃伊）和死亡的弱仔12 581頭，占產(chǎn)仔總數(shù)的19.94%，按每頭仔豬100元計算，造成仔豬經(jīng)濟損失125.8萬元，母、仔兩項共損失196.5萬元。據(jù)不完全統(tǒng)計，現(xiàn)在全州21萬頭繁殖障礙綜合征4萬頭，每年損失仔豬40萬頭，造成直接經(jīng)濟損失約6 000余萬元。我州畜牧業(yè)年產(chǎn)值21億元，已成為農(nóng)業(yè)經(jīng)濟的主要支柱產(chǎn)業(yè)，豬肉產(chǎn)量占肉類總產(chǎn)量的80%以上，養(yǎng)豬業(yè)在畜牧業(yè)中占在舉足輕重的地位。本文研究明確了造成紅河州豬繁殖障礙性疾病的主要病原，為制定和實施正確的免疫預(yù)防措施提供了科學(xué)依據(jù)。本研究成果用于生產(chǎn)實踐將產(chǎn)生巨大的社會效益和經(jīng)濟效益。

[1]殷震，劉景華.動物病毒學(xué)［M］.2版.北京：科學(xué)出版社，1997.

[2]中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院流行病防治研究所.常見病毒病實驗技術(shù)［M］.北京：科學(xué)出版社，1978.

[3]陳煥春，方六容，何啟蓋，等.豬偽狂犬病病毒鄂A株的分離鑒定［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報.1998.29（2）156-158.

[4]王瓊秋，劉伯庶，張菊忠，等.云南省紅河州豬衣原體性流產(chǎn)的病原分離鑒定［J］.中國獸醫(yī)科技，2001，31（1）：19-20.

[5]王瓊秋，劉伯庶，郭建新，等.云南省紅河州豬繁殖障礙性疫病的血清流行病學(xué)調(diào)查[J].中國獸醫(yī)雜志，2007，43（9）：35-36.

[6]王瓊秋，劉伯庶，周小伍，等.云南省紅河州豬繁殖障礙性疫病免疫效果觀察[J].貴州畜牧獸醫(yī)雜志，2007，31（3）：11-13.