耿慶華，林 穎，裴程程，胡 殊，林書銘

（沈陽出入境檢驗(yàn)檢疫局，遼寧沈陽 110016）

犬瘟熱（CD）是由犬瘟熱病毒（CDV）引起的一種急性、高度接觸性傳染病，經(jīng)常引起大批犬、貂、狐等動(dòng)物發(fā)病，經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重。該病分布于全世界，我國也時(shí)有發(fā)生。該病的傳染性強(qiáng)，不但可以感染犬科動(dòng)物，還能感染鼬科、浣熊科和貓科等多種動(dòng)物，發(fā)病率高，幾乎可以達(dá)到100%[1]。臨床初期多以感冒癥狀呈現(xiàn)，發(fā)熱、流涕、有濃眼眵并伴有咳嗽等呼吸道癥狀，嚴(yán)重者有呼吸困難、抽搐等癥狀，多預(yù)后不良[2]。CAV-2感染多可見于4月齡以下的幼犬，潛伏期為5～6天。臨床特征表現(xiàn)為持續(xù)性高熱（體溫在39．5℃左右）、咳嗽、漿液性至黏液性鼻涕、扁桃體炎、喉氣管炎和肺炎，該病往往易和犬瘟熱混合感染[3]。由于這兩種疾病臨床癥狀相似，又易于混合感染，給臨床鑒別診斷帶來很多麻煩[4-5]?？梢娊⒁环N可以同時(shí)檢測上述兩種病毒的方法具有很高的實(shí)用性和現(xiàn)實(shí)意義，本實(shí)驗(yàn)即是在傳統(tǒng)PCR方法之上建立了犬細(xì)小病毒和犬冠狀病毒的雙重PCR方法，可以一次同時(shí)檢測這兩種病毒。

1 材料與方法

1.1 毒株和臨床樣品

美國富道四聯(lián)弱毒疫苗（含犬瘟熱病毒、犬細(xì)小病毒、犬腺病毒2型、犬副流感病毒），法國酶里埃六聯(lián)弱毒疫苗（犬瘟熱病毒、犬細(xì)小病毒、犬腺病毒2型、犬副流感病毒、犬鉤端螺旋體和犬黃膽出血群），國產(chǎn)吉林五星五聯(lián)弱毒疫苗含（狂犬病病毒、犬瘟熱病毒、犬細(xì)小病毒、犬腺病毒2型、犬副流感病毒）購自沈陽觀賞動(dòng)物醫(yī)院。臨床樣品為來自遼寧省和吉林省的15家動(dòng)物醫(yī)院采集的134份病犬的鼻液和眼眵。

1.2 試劑

DNA聚合酶、dNTP、RT-PCR反應(yīng)試劑盒、DNA Marker 100 bp Ladder、膠回收試劑盒等均購自大連寶生物公司；Ambian磁珠試劑盒購自北京吉泰生物技術(shù)有限公司。

1.3 引物合成

檢索GeneBank分別得到3株CAV-2和5株CDV的全基因序列，利用生物軟件CLUSTALX進(jìn)行序列比較分析。用Oligo 6設(shè)計(jì)CAV-2和CDV特異性引物，擴(kuò)增CAV-2引物A1和A2，可擴(kuò)增片段1 108 bp，擴(kuò)增CDV引物D1和D2，可擴(kuò)增560 bp。具體序列 為 A1：5'-TGCCTTTGAAGGGTTTGA-3'，A2：5'-AGGACGCACTCTGGGAAT-3'；D1：5'-CGGCTC TTGGGTTGCAT-3'，D2：5'-CCATTCGGAGCTGTT GACATC-3'。

1.4 病毒核酸制備

分別將美國富道四聯(lián)弱毒疫苗、法國酶里埃六聯(lián)弱毒疫苗、吉林長春五星五聯(lián)弱毒疫苗干粉加入1mL DEPC純水，充分溶解后用Ambion的磁珠核酸提取試劑盒提取病毒核酸。提取程序如下：往 KF 96孔板加樣：1A孔中加入RNA Binding Beads（RNA磁珠）10 μL、Lysis/Binding Enhancer 10 μL、Lysis/Binding Solution Concentrate 130 μL 和 50 μL 弱毒疫苗樣品；往B和C行孔中加入150 μL配制好的Wash Solution 1 Concentrate；往D和E行孔中加入150 μL配制的Wash Solution 2 Concentrate；往F行孔中加入50 μL Elution Buffer。然后將KF 96孔板放入核酸提取儀中。反應(yīng)完成后取F行孔中液體放入離心管中-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 CDV RT-PCR和CAV-2 PCR方法的建立

1.5.1 CDV RT-PCR方法的建立

采用 20 μL 的 RT 反應(yīng)體系，25mM MgCl22 μL，10×RT-PCR buffer 2 μL，10 mmoL/L 的 dNTP 2 μL，反轉(zhuǎn)錄酶抑制 0.5 μL，10 U/μL 的反轉(zhuǎn)錄酶 AMV 0.5 μL，CDV 下游引物 1 μL，瞬間離心后，于 42 ℃水浴中反應(yīng)30 min。以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板PCR采用25 μL擴(kuò)增體系，并對各反應(yīng)條件進(jìn)行摸索，PCR反應(yīng)后，取5 μL PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，以DNA Ladder作Marker，溴乙啶染色后進(jìn)行凝膠成像。

1.5.2 CAV-2 PCR方法的建立

以提取美國富道四聯(lián)弱毒疫苗、法國酶里埃六聯(lián)弱毒疫苗，吉林長春五星五聯(lián)弱毒疫苗的核酸為模板，PCR反應(yīng)采用25 μL反應(yīng)體系，并對各反應(yīng)條件進(jìn)行摸索，PCR反應(yīng)后，取5 μL PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，以DNA Ladder作Marker，溴乙啶染色后進(jìn)行凝膠成像。

1.5.3 PCR產(chǎn)物的鑒定

CDV RT-PCR和CAV-2 PCR反應(yīng)產(chǎn)物用膠回收試劑盒回收后，送至大連寶生物公司進(jìn)行測序。

1.6 CDV 和CAV-2雙重PCR方法的建立及產(chǎn)物鑒定

本實(shí)驗(yàn)取法國酶里埃六聯(lián)弱毒疫苗，按照1.3方法提取核酸后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，20 μL的RT反應(yīng)體系25 mM MgCl22 μL，10×RT-PCR buffer 1 μL，10 mmoL/L 的 dNTP 1 μL，反轉(zhuǎn)錄酶抑制 0.5 μL，10 U/ μL 的反轉(zhuǎn)錄酶 AMV 0.5 μL，CDV 下游引物0.5 μL，瞬間離心后，于42 ℃水浴中反應(yīng)30 min。以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的cDNA和提取的總核酸為模板做雙重PCR，PCR采用25 μL擴(kuò)增體系，并對各反應(yīng)條件進(jìn)行摸索，PCR反應(yīng)后，取5 μL PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，以DNA 100 bp Ladder作Marker，溴乙啶染色后進(jìn)行凝膠成像。并將擴(kuò)增結(jié)果，經(jīng)膠回收純化試劑盒純化后送至大連寶生物工程有限公司測序。

1.7 特異性試驗(yàn)

提取美國富道四聯(lián)弱毒疫苗、法國酶里埃六聯(lián)弱毒疫苗、國產(chǎn)吉林五星五聯(lián)弱毒疫苗的核酸用CAV-2和CDV 特異性引物擴(kuò)增。

1.8 敏感性試驗(yàn)

提取吉林五星弱毒疫苗，提取后用分光光度計(jì)測定核酸濃度，取5 μL核酸加入到45 μL蒸餾水中，再從中取出5 μL進(jìn)行10倍梯度稀釋，依次為100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。分別做 PCR 和 RTPCR。

1.9 臨床樣品的檢測

將來自遼寧省和吉林省的15家動(dòng)物醫(yī)院采集的134份病犬的鼻液和眼眵樣品，用商品化膠體金試紙條和本實(shí)驗(yàn)建立的方法同時(shí)進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果

2.1 CDV RT-PCR和CAV-2 PCR擴(kuò)增結(jié)果

經(jīng)對反轉(zhuǎn)錄及PCR反應(yīng)過程中的退火溫度、延伸時(shí)間、循環(huán)次數(shù)等條件的優(yōu)化，確定最佳反應(yīng)條件，確定反應(yīng)體系為25 μL：10×PCR buffer 2.5 μL、dNTP 2.5 μL、CDV 上下游引物各 0.5 μL、Taq 酶1 μL，模板 5 μL，去離子水補(bǔ)足到 25 μL。PCR 循環(huán)參數(shù)為：94 ℃ 預(yù)變性3 min；95 ℃ 30 s，55 ℃30 s，72 ℃ 30 s，35 個(gè)循環(huán)后；72 ℃延伸 10 min。CAV-2和CDV反應(yīng)產(chǎn)物分別擴(kuò)增出特異性條帶1 108 bp和560 bp，與預(yù)期結(jié)果相符合（見圖1）。

2.2 PCR產(chǎn)物的鑒定

CDV RT-PCR和CAV-2 PCR反應(yīng)產(chǎn)物用膠回收試劑盒回收后，送大連寶生物公司進(jìn)行測序。與GeneBank發(fā)表的基因序列同源性在99%以上。

2.3 特異性檢測結(jié)果

提取美國富道四聯(lián)弱毒疫苗、法國酶里埃六聯(lián)弱毒疫苗、國產(chǎn)吉林五星五聯(lián)弱毒疫苗的核酸，其中分別含有4～6種病毒核酸，用CAV-2和CDV 特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果表明均只擴(kuò)增出CAV-2和CDV特異性條帶，未出現(xiàn)其它條帶。

2.4 CDV 和CAV-2雙重PCR 擴(kuò)增結(jié)果及鑒定

經(jīng)對PCR反應(yīng)過程中的退火溫度、延伸時(shí)間、循環(huán)次數(shù)等條件的優(yōu)化，確定最佳反應(yīng)條件，確定反應(yīng)體系為25μL：10×PCR buffer 2.5 μL、dNTP2.5 μL、CDV 和 CAV-2 上下游引物各 0.25 μL、Taq 酶 0.5 μL、反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的 cDNA 模板為 3.5 μL、提取的總核酸模板1.5 μL，去離子水補(bǔ)足到25 μL。PCR循環(huán)參數(shù)為：94 ℃ 預(yù)變性3 min，95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35 個(gè)循環(huán)后，72 ℃延伸10 min。反應(yīng)產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖2所示。將雙重PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，經(jīng)膠回收純化試劑盒純化后送至大連寶生物工程有限公司測序，擴(kuò)增的2個(gè)條帶測序結(jié)果分別與GeneBank上CDV 和CAV-2同源性均在99%以上。

2.5 敏感性試驗(yàn)

提取吉林五星弱毒疫苗總核酸，用分光光度計(jì)測定提取的質(zhì)量濃度為9 260 ng/μL，取5 μL核酸加入到45 μL蒸餾水中，再從中取出5 μL進(jìn)行10倍梯度稀釋，依次為 100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，做雙重PCR。結(jié)果兩種方法的敏感性均可達(dá)檢測10-4的稀釋度，相當(dāng)于4.63 ng總核酸量，電泳結(jié)果如圖3所示。

2.6 臨床樣品的檢測結(jié)果

同時(shí)用商品化膠體金試紙條及本實(shí)驗(yàn)室建立的單項(xiàng)和雙重PCR方法對采集的134份樣品檢測，檢測結(jié)果如表1所示。結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)室建立的PCR方法的敏感性明顯高于商品化膠體金試紙條。將雙重PCR方法和單項(xiàng)PCR方法檢測結(jié)果相比，二者有較高的符合率，陽性符合率在98%以上，表明本實(shí)驗(yàn)建立的雙重PCR方法有較好的特異性和敏感性。

表1 臨床樣品商品化膠體金試紙條、單項(xiàng)和雙重PCR方法檢測對比試驗(yàn)結(jié)果

3 討論與結(jié)論

多重PCR技術(shù)是在同一PCR體系中加入多對引物，對多個(gè)目的基因同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增的分子生物學(xué)診斷方法，可同時(shí)檢測多種病原體或多個(gè)基因型，達(dá)到對多種疾病的同步診斷，縮短檢測時(shí)間的目的[6-8]。本實(shí)驗(yàn)在優(yōu)化單項(xiàng)PCR檢測方法基礎(chǔ)上，初步建立了雙重PCR方法，即一次實(shí)驗(yàn)可同時(shí)快速鑒別診斷CAV 和CDV兩種病毒感染的檢測技術(shù)，為預(yù)防和控制這兩種疾病提供快速診斷方法。

由于雙重PCR反應(yīng)涉及到兩種模板和兩對引物，因而容易出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增或不能擴(kuò)增，所以我們在設(shè)計(jì)引物的時(shí)候，注重退火溫度，GC含量及基因片段長度的選擇。本實(shí)驗(yàn)在進(jìn)行CDV 和CAV單項(xiàng)PCR的基礎(chǔ)上，通過對病毒引物、dNTP、模板量及反應(yīng)溫度的篩選，建立了CDV 和CAV雙重PCR的快速特異的鑒別診斷方法，通過臨床樣品的檢測，結(jié)果顯示該雙重PCR方法的敏感性明顯高于商品化膠體金試紙條的檢測結(jié)果，并檢測出兩種病毒混合感染樣品為10例，與單項(xiàng)PCR檢測結(jié)果的符合率在98%以上，表明該方法有很好的實(shí)用性，可以在臨床中應(yīng)用推廣。

犬瘟熱毒病和犬腺病毒病2型是犬的兩種急性的傳染病，發(fā)病時(shí)均能引起發(fā)熱、咳嗽、流鼻涕，有濃眼眵等癥狀。在臨床上兩者很難鑒別診斷，本實(shí)驗(yàn)即是從該角度出發(fā)，建立了CDV和CAV-2雙重PCR方法，可以在一個(gè)PCR反應(yīng)體系中同時(shí)檢測兩種病毒，提高了檢測的效率，同時(shí)又可將兩者相互鑒別，具有很好的臨床應(yīng)用價(jià)值。同時(shí)該試驗(yàn)引入了磁珠法應(yīng)用全自動(dòng)核酸提取系統(tǒng)提取核酸，避免了以往病毒核酸的DNA和RNA分開提取的繁瑣程序，更加適合大量臨床樣品的檢測。

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