許宗麗，謝芝勛，謝麗基，劉加波，謝志勤，鄧顯文，范 晴

（1.廣西大學(xué)，動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530004；2.廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所 廣西畜禽疫苗新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530001）

鴨源新城疫是由鴨源新城疫病毒引起的一類急性、高度接觸性和致死性的傳染病。早期研究發(fā)現(xiàn)，鴨對(duì)致病性APMV-l具有極強(qiáng)的抵抗力，僅表現(xiàn)為健康帶毒，即使強(qiáng)毒感染也不致病。但近年來發(fā)現(xiàn)引起高致病性和死亡性的鴨源新城疫病毒的自然流行，對(duì)養(yǎng)鴨業(yè)危害嚴(yán)重。河北、福州、浙江、山西、山東、河南等地陸續(xù)報(bào)道該病的發(fā)生和流行[1-6]，上述研究表明，鴨源新城疫病毒的感染呈上升趨勢(shì)，將對(duì)我國的養(yǎng)鴨業(yè)產(chǎn)生巨大危害。

鴨圓環(huán)病毒（Duck circovirus，DuCV）是圓環(huán)病毒科（Circoviridae）圓環(huán)病毒屬（Circovirus）的一成員，首次在德國報(bào)道[7-8]。近年來，相繼在匈牙利、美國、及我國臺(tái)灣、山東、遼寧、福建、廣東和廣西等地發(fā)現(xiàn)有鴨圓環(huán)病毒造成鴨感染或發(fā)病的報(bào)道[9-11]。DuCV造成鴨發(fā)病的主要臨床表現(xiàn)為發(fā)育不良、體重下降及羽毛凌亂等，病理組織表現(xiàn)為法氏囊出現(xiàn)壞死、淋巴細(xì)胞減少和組織細(xì)胞增多?？椉?xì)胞增生現(xiàn)象、感染動(dòng)物的淋巴組織逐漸萎縮導(dǎo)致免疫功能下降或免疫反應(yīng)抑制進(jìn)而提高了二重或多重感染的幾率是圓環(huán)病毒感染的特征，與其它病原菌或病毒的混合感染情形非常復(fù)雜。柴同杰[12]對(duì)山東的櫻桃谷鴨群鴨圓環(huán)病毒及混合感染的調(diào)查表明，鴨圓環(huán)病毒與鴨Ⅰ型肝炎、鴨疫里氏桿菌及大腸桿菌的混合感染率較高。屈素潔等[13]對(duì)廣西部分地區(qū)鴨圓環(huán)病毒感染情況進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果表明存在與鴨疫里氏桿菌、新城疫病毒、禽流感病毒和鴨肝炎病毒等病原混合感染現(xiàn)象。

混合感染給鴨疾病診斷帶來了許多困難，不能僅通過臨床表現(xiàn)做出診斷，需要借助于分子診斷技術(shù)。病毒的分離、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等這些方法耗時(shí)，不利于病毒的控制。PCR方法具有操作簡(jiǎn)便、敏感性高、特異性強(qiáng)和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，已成為動(dòng)物病原檢測(cè)的重要方法。特別是多重PCR具有可同時(shí)檢測(cè)、鑒別多種病原體的特點(diǎn)，在臨床多種病原混合感染的鑒別診斷上具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和很高的實(shí)用價(jià)值[14-16]。 至今尚未見有應(yīng)用二重PCR對(duì)鴨新城疫病毒和鴨圓環(huán)病毒的檢測(cè)和診斷報(bào)道。本研究設(shè)計(jì)了2對(duì)引物，建立了鴨新城疫病毒和鴨圓環(huán)病毒的二重PCR的檢測(cè)方法。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

2×Taq PCR Mix購自北京天根生物技術(shù)公司；TIANamp 血液/細(xì)胞/組織 基因DNA提取試劑盒購自天根公司；RNA提取試劑Trizol LS Reagent購自Invitrogen公司。

1.2 病毒株

鴨瘟病毒AV1221、鴨肝炎病毒、NDV-F48E9、NDV-Lasota購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；鴨新城疫病毒、鴨圓環(huán)病毒、番鴨細(xì)小病毒、鴨源小鵝瘟病毒、鴨H9亞型流感病毒、鴨疫里氏桿菌、大腸桿菌、禽多殺性巴氏桿菌等由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 引物設(shè)計(jì)和合成

下載GenBank中鴨新城疫病毒F基因和鴨圓環(huán)病毒的V1/rep基因序列，利用Lasergene軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，在保守區(qū)運(yùn)用軟件Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物。引物由上海Invitrogen公司合成。引物序列見表1。

表1 二重PCR引物序列

1.4 核酸的提取

參照TIANamp 血液/細(xì)胞/組織基因DNA提取試劑盒說書，提取鴨圓環(huán)病毒、番鴨細(xì)小病毒、鴨瘟病毒AV1221、鴨源小鵝瘟病毒、鴨疫里氏桿菌、大腸桿菌、禽多殺性巴氏桿菌的DNA；參照Trizol LS Reagent使用說明書和文獻(xiàn)[17]抽提鴨新城疫病毒、NDV-F48E9、NDV-Lasota、鴨肝炎病毒、鴨H9亞型流感病毒的RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，置-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 二重PCR反應(yīng)條件優(yōu)化

對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化：對(duì)鴨新城疫病毒引物、鴨圓環(huán)病毒引物、模板等用量進(jìn)行優(yōu)化，多次重復(fù)試驗(yàn)后確定最佳反應(yīng)用量。將溫度按50～65 ℃依次遞增，多次重復(fù)試驗(yàn)后確定最佳退火溫度。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物上瓊脂糖凝膠電泳儀進(jìn)行電泳鑒定。

1.6 二重PCR的特異性試驗(yàn)

利用優(yōu)化好的二重PCR反應(yīng)體系，以鴨新城疫病毒、NDV-F48E9、NDV-Lasota、鴨圓環(huán)病毒、番鴨細(xì)小病毒、鴨瘟病毒AV1221、鴨肝炎病毒、鴨源小鵝瘟病毒、鴨H9亞型流感病毒、鴨疫里氏桿菌、大腸桿菌、禽多殺性巴氏桿菌為待檢樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢驗(yàn)二重PCR方法的特異性。

1.7 二重PCR的靈敏性試驗(yàn)

使用Beckman UV-800紫外分光光度計(jì)測(cè)定鴨NDV和DuCV的核酸濃度，并按10倍梯度稀釋，進(jìn)行二重PCR擴(kuò)增。同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照，評(píng)估該二重PCR檢測(cè)方法的敏感性。

1.8 二重PCR的應(yīng)用

應(yīng)用建立的二重PCR方法對(duì)玉林、南寧、?？谒蜋z的38份鴨病料進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 二重PCR反應(yīng)體系的構(gòu)建和優(yōu)化

通過對(duì)各反應(yīng)條件的優(yōu)化，最終確定二重PCR反應(yīng)體系為 25 μL：2×Taq PCR Mix 12.5 μL、DuNDV上下引物（50 μmol/mL）各0.1 μL、DuCV上下引物（50 μmol/mL）各 0.5 μL、模板各 2 μL，加水至25 μL。優(yōu)化退火溫度（圖1），確定最佳的反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min、94 ℃ 1 min、55 ℃ 1 min、72 ℃1 min，35個(gè)循環(huán)后，72 ℃ 10 min（圖2）。

2.2 二重PCR 特異性試驗(yàn)

用本研究建立的二重PCR方法對(duì)鴨新城疫病毒、NDV-F48E9、NDV-Lasota、鴨圓環(huán)病毒、番鴨細(xì)小病毒、鴨瘟病毒AV1221、鴨肝炎病毒、鴨源小鵝瘟病毒、鴨H9亞型流感病毒、鴨疫里氏桿菌、大腸桿菌、禽多殺性巴氏桿菌進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示：從新城疫病毒擴(kuò)增出493 bp的特異性條帶，鴨圓環(huán)病毒擴(kuò)增出218 bp的特異性條帶；而番鴨細(xì)小病毒、鴨瘟病毒、鴨肝炎病毒、鴨源小鵝瘟病毒、鴨H9亞型流感病毒、鴨疫里氏桿菌、大腸桿菌、禽多殺性巴氏桿菌均無特異性條帶出現(xiàn)（圖3）。

2.3 二重PCR靈敏性試驗(yàn)

用DU 800紫外分光光度計(jì)測(cè)得鴨新城疫病毒cDNA濃度和鴨瘟病毒DNA濃度分別為40 ng/μL，20 ng/μL，應(yīng)用建立的二重PCR方法對(duì)10倍梯度稀釋的鴨新城疫、鴨圓環(huán)的核酸模板進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示：建立的二重PCR方法對(duì)鴨新城疫的核酸最低檢出限為40 fg；對(duì)鴨圓環(huán)的核酸最低檢出限為20 fg（圖4）。

2.4 二重PCR的臨床應(yīng)用

應(yīng)用建立的二重PCR方法對(duì)玉林、南寧、?？谒蜋z的38份鴨病料進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)只有鴨圓環(huán)病毒陽性5份，與病毒的分離的結(jié)果相符（圖5）。

3 討 論

PCR方法具有操作簡(jiǎn)便、敏感性高、特異性強(qiáng)和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。二重或多重PCR是一種特殊的PCR 技術(shù)，但并不是簡(jiǎn)單疊加。在一個(gè)體系中由于存在多種模板和引物，所以需要防止引物和模板之間的非特異性結(jié)合，避免非特性條帶的出現(xiàn)，還要盡量避免引物二聚體的產(chǎn)生。同時(shí)，目的片段的大小有合適的梯度和各引物退火條件盡可能相同，以確保2種擴(kuò)增產(chǎn)物量相對(duì)平衡。本研究根據(jù)鴨源新城疫病毒和鴨圓環(huán)病毒的基因序列設(shè)計(jì)了一套特異性引物，一次二重PCR就能鑒別出兩種病毒。通過優(yōu)化反應(yīng)體系，確定鴨源新城疫病毒和鴨圓環(huán)病毒最佳的引物用量分別為 0.1 μL（50 μmol/mL）和 0.5 μL（50 μmol/mL）。對(duì)反應(yīng)的退火溫度進(jìn)行優(yōu)化，在50～65 ℃都能擴(kuò)增出特異性片段，表明本研究優(yōu)化的反應(yīng)體系能在一定的溫度的范圍內(nèi)確保擴(kuò)增的相對(duì)平衡。

水禽圓環(huán)病毒不能在細(xì)胞和禽胚上生長，而且該病毒多以亞臨床感染形式出現(xiàn)，所以用傳統(tǒng)的分離病毒、動(dòng)物試驗(yàn)方法無法進(jìn)行診斷。最初診斷圓環(huán)病毒主要靠病理組織和電鏡觀察，但這兩種方法都需要專業(yè)的技能，而敏感性不高。實(shí)踐證明，PCR檢測(cè)是現(xiàn)今最有效可行的方法。圓環(huán)病毒的共同特征是引起宿主的免疫抑制而導(dǎo)致繼發(fā)感染或二重及多重感染，鴨圓環(huán)病毒的感染也同樣對(duì)免疫力就有抑制作用[12]。因此，本研究建立的鴨圓環(huán)病毒和鴨新城疫病毒的二重PCR的檢測(cè)方法可用于鴨圓環(huán)病毒感染造成的免疫力減低導(dǎo)致的鴨源新城疫病毒的混合感染，既可以節(jié)約時(shí)間和成本，又可以減少污染。

用本研究建立的鴨圓環(huán)病毒和鴨新城疫病毒的二重PCR的檢測(cè)技術(shù)，對(duì)從2011年10月至2012年3月的玉林、柳州和南寧送檢的38份病料進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)到鴨圓環(huán)病毒的感染率為13.1%（5/38）。表明廣西鴨群中存在一定的鴨圓環(huán)病毒的感染，和屈素潔等[13]對(duì)廣西部分地區(qū)鴨圓環(huán)病毒感染情況進(jìn)行調(diào)查結(jié)果相一致。在這些樣品中未檢出鴨新城疫病毒，與病毒的分離結(jié)果一致。

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