謝麗基，謝芝勛，劉加波，龐耀珊，鄧顯文，謝志勤，范 晴

（廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所，廣西南寧 530001）

鴨I型肝炎病毒（duck hepatitis virus Type I，DHV I）是雛鴨的一種高度致死性的病毒性傳染病的病原[1]。該病主要侵害4周齡以內(nèi)的雛鴨，死亡率高達(dá)90%以上，是危害養(yǎng)鴨業(yè)最為嚴(yán)重的傳染病之一。番鴨細(xì)小病毒（Muscovy duck ling parvovirus，MDPV），是危害番鴨養(yǎng)殖的重要病原，可引起1～3周齡雛番鴨發(fā)病，致死率達(dá)到50%～80%[2]。這兩種病毒是雛鴨最易感并且致死率也非常高的病毒。

目前，這兩種病毒的傳統(tǒng)檢測方法有血清中和試驗(yàn)、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)和ELISA等[3-6]，但這些檢測存在耗時長、敏感性較低、不易標(biāo)準(zhǔn)化等缺點(diǎn)，在實(shí)際應(yīng)用中具有一定的局限性?，F(xiàn)已建立的鴨I型肝炎病毒 RT-PCR[7]和番鴨細(xì)小病毒PCR[8]檢測方法，檢測的速度和敏感性優(yōu)于傳統(tǒng)的檢測方法。

二重RT-PCR實(shí)現(xiàn)了一管二檢的目的，具有高通量、低成本、高效率等優(yōu)點(diǎn)。目前，還未見有應(yīng)用二重RT-PCR技術(shù)對鴨I型肝炎病毒和番鴨細(xì)小病毒進(jìn)行檢測和診斷的報(bào)道，本研究設(shè)計(jì)了多對引物，建立了鴨I型肝炎病毒和番鴨細(xì)小病毒二重RT-PCR快速檢測方法，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑 病毒RNA/DNA快速純化試劑盒和One Step RT-PCR試劑盒購自大連寶生物工程有限公司；PUM-T試劑盒和DNA片斷膠回收試劑盒購自廣州東盛生物科技有限公司。PCR儀為美國Per k in Elmer Cetus公司生產(chǎn)的PE9600儀。

1.2 病毒株 鴨I型肝炎病毒 AV2111株購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；番鴨細(xì)小病毒、鴨圓環(huán)病毒、小鵝瘟病毒、鴨副黏病毒、鴨瘟病毒和H9亞型禽流感等由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 二重RT-PCR方法的建立

1.3.1 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)鴨I型肝炎病毒和番鴨細(xì)小病毒的基因保守序列，通過Blast驗(yàn)證，設(shè)計(jì)了2對特異性引物（表1）。

表1 試驗(yàn)使用引物序列

1.3.2 核酸的提取 根據(jù)病毒RNA/DNA快速純化試劑盒說明書，提取AV2111、番鴨細(xì)小病毒、鴨圓環(huán)病毒、小鵝瘟病毒、鴨副黏病毒、鴨瘟病毒和H9亞型禽流感的RNA/DNA。參照Sambroo k方法測定核酸的濃度和純度[9]，置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 RT-PCR各反應(yīng)條件的優(yōu)化 RT-PCR采用一步法進(jìn)行。在50 uL的反應(yīng)體系中含：PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 2uL，2×1Step Buffer 25 uL，適當(dāng)濃度的上游引物和下游引物，模板各1 uL，以無RNase dH2O補(bǔ)足50 uL。對RT-PCR各循環(huán)參數(shù)和各引物濃度等進(jìn)行優(yōu)化，以確定最佳的RT-PCR模式。

1.4 二重RT-PCR的敏感性試驗(yàn) 測定鴨I型肝炎病毒和番鴨細(xì)小病毒的RNA/DNA含量后，按10倍遞增稀釋，同時加入到最佳的RT-PCR反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增，檢測其敏感性。

1.5 二重RT-PCR的特異性試驗(yàn) 將已提取的鴨I型肝炎病毒、番鴨細(xì)小病毒、鴨圓環(huán)病毒、小鵝瘟病毒、鴨副黏病毒、鴨瘟病毒和H9亞型禽流感的RNA/DNA，分別加入到二重RT-PCR反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增，檢測其特異性。

1.6 PCR產(chǎn)物的電泳分析及克隆測序 取50 uL RTPCR產(chǎn)物與5 uL溴酚蘭混合，在10 g/L瓊脂糖凝膠中電泳，經(jīng)溴化乙錠染色后，在紫外光下觀察拍照，與DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量作比較，分析并記錄結(jié)果。在紫外燈下用刀片切割所需的片段，然后用凝膠回收試劑盒純化回收。取適量純化回收的PCR產(chǎn)物，與PUM-T于22 ℃連接10 min，轉(zhuǎn)化DH5α大腸埃希氏菌。挑取在含氨芐青霉素的選擇培養(yǎng)基上長出的白色菌落37 ℃培養(yǎng)，用PCR方法進(jìn)行快速鑒定，陽性克隆菌送大連寶生生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果進(jìn)行Blast比對分析。

1.7 檢測臨床樣品 利用建立的鴨I型肝炎病毒和番鴨細(xì)小病毒二重RT-PCR快速檢測方法，對2011年于廣西地區(qū)鴨群收集的180份病料進(jìn)行檢測，并將PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆測序分析，評價其臨床實(shí)用性。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR條件優(yōu)化 通過對RT-PCR的引物濃度、各反應(yīng)溫度、時間及循環(huán)次數(shù)等進(jìn)行優(yōu)化，最后確定PCR中MDPV474-1和MDPV474-2引物的最佳工作終濃度為0.25 uM，DHV202-1和DHV202-2引物的最佳工作終濃度為0.15 uM，RT-PCR的最佳反應(yīng)模式為50 ℃反轉(zhuǎn)錄30 min，94 ℃變性2 min，然后進(jìn)入94 ℃變性1min，55 ℃退火1min，72 ℃延伸1 min的循環(huán)，共進(jìn)行35個循環(huán)；最后再經(jīng)72 ℃延伸10 min后，于4 ℃結(jié)束反應(yīng)。

2.2 RT-PCR敏感性試驗(yàn)結(jié)果 經(jīng)過敏感性測定，該RT-PCR最低能檢出100 fg鴨I型肝炎病毒和番鴨細(xì)小病毒的RNA或DNA模板（圖1）。

2.3 二重RT-PCR的特異性 應(yīng)用該程序?qū)咺型肝炎病毒和番鴨細(xì)小病毒及對照病原（鴨圓環(huán)病毒、小鵝瘟病毒、鴨副黏病毒、鴨瘟病毒和H9亞型禽流感）的核酸進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，結(jié)果含有鴨I型肝炎病毒和番鴨細(xì)小病毒核酸模板的樣品均能擴(kuò)增出與試驗(yàn)設(shè)計(jì)大小相符的擴(kuò)增條帶，而其它對照病原在相同位置卻無特異性擴(kuò)增條帶（圖2）。

2.4 測序結(jié)果與序列分析 經(jīng)測序結(jié)果分析及Blast比對分析，證明了鴨I型肝炎病毒和番鴨細(xì)小病毒RTPCR擴(kuò)增產(chǎn)物，大小分別為202 bp和474 bp，與設(shè)計(jì)大小相符。PCR產(chǎn)物的核酸序列與引物設(shè)計(jì)模板的基因?qū)?yīng)片段的同源性一致。

2.5 二重RT-PCR檢測臨床病料 利用建立的二重RTPCR方法，對廣西地區(qū)鴨群收集的180份病料進(jìn)行檢測，結(jié)果檢出鴨I型肝炎病毒2份（陽性率為1.1%），檢出番鴨細(xì)小病毒18份（陽性率為10%），并未出現(xiàn)混合感染。擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物序列分析表明，RT-PCR擴(kuò)增的為鴨1型肝炎病毒和番鴨細(xì)小病毒的特異性片段。

3 討論

鴨I 型肝炎病毒和番鴨細(xì)小病毒是危害雛鴨的最重要病原，并且感染發(fā)病后致死率非常高，因此迫切需要建立一種快速敏感的鴨I 型肝炎病毒和番鴨細(xì)小病毒檢測方法，在感染早期就能檢測出這些病毒，從而為這些病的控制爭取寶貴的時間。

PCR方法具有操作簡便、敏感性高、特異性強(qiáng)和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。多重PCR是一種特殊的PCR技術(shù)，由于多重PCR反應(yīng)體系中存在二種以上的引物和模板，反應(yīng)過程中相互之間會有一定的影響，而且反應(yīng)總是有利于較小片段擴(kuò)增的原則，為使多重PCR中各片段都得到最佳擴(kuò)增，應(yīng)盡可能使各擴(kuò)增片段之間大小不要相差太懸殊，各引物所需擴(kuò)增條件接近一致，特別各引物退火應(yīng)盡可能相同，最終確保二種擴(kuò)增產(chǎn)物量相對平衡[10]。本試驗(yàn)中，我們根據(jù)鴨I型肝炎病毒和番鴨細(xì)小病毒的基因序列設(shè)計(jì)出特異性引物，從而達(dá)到一次二重RT-PCR擴(kuò)增（反轉(zhuǎn)錄和PCR一步進(jìn)行，節(jié)約了反應(yīng)的時間和工作量），就可檢測鑒別鴨I型肝炎病毒和番鴨細(xì)小病毒的目的；通過對引物用量和RT-PCR擴(kuò)增條件優(yōu)化，鴨I型肝炎病毒和番鴨細(xì)小病毒二種引物的最佳工作濃度分別為0.25 uM和0.15 uM，說明了要使二重RT-PCR反應(yīng)體系中每一目的片段都得到最佳擴(kuò)增結(jié)果，適當(dāng)?shù)囊餄舛仁鞘种匾摹?/p>

本研究建立的鴨I型肝炎病毒和番鴨細(xì)小病毒二重RT-PCR方法全程（包括核酸提取、RT-PCR擴(kuò)增，凝膠電泳）僅需約5小時，最低能同時檢出100 fg鴨I型肝炎病毒和番鴨細(xì)小病毒的RNA/DNA，這說明該二重RT-PCR具有很高的敏感性，可以同時進(jìn)行鴨I型肝炎病毒和番鴨細(xì)小病毒的檢測和鑒別，這對于在鴨I型肝炎病毒和番鴨細(xì)小病毒的發(fā)病早期提供準(zhǔn)確的診斷結(jié)果，切斷其傳播途徑有重要意義。可見，這項(xiàng)技術(shù)具有廣闊的應(yīng)用前景，對鴨養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展有著重要的現(xiàn)實(shí)意義，對食品安全也有著不可忽略的公共衛(wèi)生意義。

利用建立的二重RT-PCR方法，對廣西地區(qū)鴨群收集的180份病料進(jìn)行檢測，結(jié)果檢出鴨I型肝炎病毒陽性率為1.1% ，檢出番鴨細(xì)小病毒陽性率為10%，說明廣西地區(qū)的鴨群存在鴨I型肝炎病毒的感染，并且番鴨細(xì)小病毒的感染普遍存在。該二重RTPCR方法的建立，對廣西地區(qū)鴨群的疫病控制有指導(dǎo)意義。

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