張 康 ，龔振華 ，李 蕾 ，王洪偉 ，李玉清 ，張麗娟 ，王麗萍，莊青葉，于建敏，李金平，劉國慶

（1.中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032；2.青島易邦生物股份有限公司，山東青島 266032；3.諸城市畜牧獸醫(yī)管理局，山東諸城 262200；4.膠南市興牧科技服務(wù)中心，山東膠南 266400）

雞彎曲菌病又稱為雞弧菌性肝炎，主要由空腸彎曲菌感染引起的幼雞或成年雞傳染病。本病以肝出血壞死性肝炎伴發(fā)脂肪浸潤，主要呈慢性經(jīng)過為特征，影響雞的生產(chǎn)性能，可以給養(yǎng)雞業(yè)造成較大的經(jīng)濟(jì)損失。傳統(tǒng)的細(xì)菌學(xué)分離方法是檢測雞彎曲菌病的主要方法[1]，但因該菌培養(yǎng)需要微厭氧培養(yǎng)系統(tǒng)、營養(yǎng)條件苛刻、增菌分離及生化鑒定所需時(shí)間長，使得該方法在實(shí)際操作中顯得非常繁瑣與不便。臨床實(shí)踐中，有時(shí)需要采用空腸彎曲菌快速檢測方法進(jìn)行臨床診斷。近年來，PCR檢測方法以其特異性強(qiáng)、靈敏度高和快速簡便等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)在雞彎曲菌病的檢測中得到了廣泛的應(yīng)用[2-5]。我們采用Nested-PCR方法，對(duì)某雞場發(fā)生的空腸彎曲菌感染雞進(jìn)行了快速診斷研究，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料

1.1 PCR對(duì)照樣品

陽性對(duì)照樣品：空腸彎曲菌（ATCC33560）由中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心保存。

陰性對(duì)照樣品：市場上購買的健康雞肝組織。

1.2 引物

采用高正琴等[6]報(bào)道的2對(duì)針對(duì)彎曲菌fl a A區(qū)的 Nested-PCR 的 引 物，F(xiàn)1：5'-GGAGGATCCATGGGA TTTCGTATTAAC-3'；R1：5'-TTTGGATTCCTACTGT AGTAATCTTAA-3'。F1+R1 擴(kuò) 增 長 度 為 1 719 bp。F2：5'-ATGAAAGAAAACTATGGCCG CTTGTCT-3'； R2：5'-AGTCTACATCACGGATTTG CGATTCTG-3'，F(xiàn)2+R2擴(kuò)增長度為640 bp。

1.3 其他試劑

1.3.1 生化試劑 Taq酶、buffer、dNTPs、DNA Mar k er（均為大連寶生物工程公司）。

1.3.2 樣品保存液 商品化DNA保存液（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）。

1.3.3 核酸純化試劑盒 微量DNA快速純化試劑盒（VWI產(chǎn)品）。

1.4 檢測樣品

從某發(fā)病雞場臨床采集的雞肝臟、脾臟、盲腸和泄殖腔糞便。

2 方法

2.1 樣品的采集

取發(fā)病雞進(jìn)行組織解剖，取病變肝臟、脾臟、盲腸、泄殖腔糞便各1 g左右，分別快速剪碎，置于10 mL DNA保存液，4 ℃ 保存。

2.2 樣品 DNA 的提取

按微量DNA快速純化試劑盒操作說明書進(jìn)行，主要是取組織樣品經(jīng)蛋白酶K消化，置于DNA 結(jié)合柱，經(jīng)離心沖洗，加洗脫液沖洗，收集純化的DNA樣品，以備下一步使用。

2.3 Nested-PCR

參考高正琴等[6]方法，第一次PCR反應(yīng)用純化的組織樣品DNA作為模板，用F1及R1引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增理論設(shè)計(jì)長度為1 719 bp的DNA大片段；第二次PCR反應(yīng)進(jìn)一步取第一次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物作為模板，用F2及R2引物進(jìn)行Nested-PCR反應(yīng)，擴(kuò)增理論設(shè)計(jì)長度為640 bp的小片段。

3 結(jié)果

3.1 病雞的臨床表現(xiàn)

雞場發(fā)病率為5%，病雞表現(xiàn)精神沉郁，食欲減少，病初拉稀，有飲水欲，肛門周圍污染糞便。腹部增大，雞冠蒼白，出現(xiàn)急性死亡現(xiàn)象。多數(shù)病雞轉(zhuǎn)為慢性，表現(xiàn)精神萎頓，可見鱗片狀皮屑、逐漸消瘦、飼料消耗減低等。

3.2 剖檢病理變化

病死雞尸體脫水、消瘦，后部羽毛污染；肝被膜下或?qū)嵸|(zhì)內(nèi)有大小不等、數(shù)目不一的血泡腫，肝臟腫大、邊沿鈍圓、瘀血，有出血點(diǎn)和壞死點(diǎn)，肝質(zhì)地硬化易碎，呈網(wǎng)格狀碎塊；脾臟腫大，有壞死斑點(diǎn)；膽囊腫大，色澤呈黃綠色，膽汁充盈、黏稠；心包積液，呈透明的橙黃色，心肌松軟無力，心肌有黃色壞死灶；腎腫大褪色；脾臟極度腫大變圓，呈斑駁狀外觀；腺胃松弛無力，乳頭偏平，肌胃和腺胃及空腸黏膜有不同程度出血、瘀血，直腸部位出血及卡他性腸炎。

3.3 PCR結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)中的組織樣品，及對(duì)照樣品用Nested-PCR 檢測后，可見到如下實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

陽性對(duì)照樣品，空腸彎曲菌（ATCC33560）經(jīng)Nested-PCR檢測后，第一次PCR和第二次PCR反應(yīng)分別擴(kuò)增出一條長度為1 719 bp和640 bp的特異性DNA片段，符合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求。陰性對(duì)照樣品經(jīng)Nested-PCR檢測后未出現(xiàn)特異性DNA條帶，說明實(shí)驗(yàn)結(jié)果成立。

病雞組織樣品：病雞組織樣品肝臟、脾臟、盲腸、泄殖腔糞便等四種組織樣品經(jīng)Nested-PCR檢測后，第一次PCR和第二次PCR反應(yīng)分別擴(kuò)增出一條長度為1 719 bp和640bp的特異性DNA片段，符合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求（圖1、2），說明病雞存在空腸彎曲菌感染。

4 討論

4.1 空腸彎曲菌是一種容易引起感染的疾病，通常由于飼養(yǎng)條件和管理方式存在不足，而導(dǎo)致雞感染發(fā)病，尤其是內(nèi)臟感染，引起雞生產(chǎn)性能降低、發(fā)育遲鈍、飼料報(bào)酬低，造成養(yǎng)雞場的經(jīng)濟(jì)損失。過去的資料表明，空腸彎曲菌的發(fā)病率為1%~2%，本研究中發(fā)現(xiàn)，該病雞場的發(fā)病率達(dá)到5%，病雞肝臟、腎臟、脾臟等實(shí)質(zhì)器官出現(xiàn)明顯的出血、腫大等病理變化，導(dǎo)致養(yǎng)雞場的經(jīng)濟(jì)損失較為嚴(yán)重，提示雞空腸彎曲菌對(duì)雞的致病性有可能加強(qiáng)，應(yīng)引起重視。

4.2 傳統(tǒng)的檢測空腸彎曲菌的方法是通過細(xì)菌培養(yǎng)，再進(jìn)行生化鑒定，需要一周以上的診斷時(shí)間，且細(xì)菌培養(yǎng)條件苛刻，對(duì)實(shí)驗(yàn)條件具有較高的要求。故傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)鑒定方法只適用于條件較好的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，不適宜推廣。本研究采用Nested-PCR 對(duì)臨床采集的空腸彎曲菌感染雞樣品進(jìn)行檢測，檢測的發(fā)病雞樣品經(jīng)第一次PCR反應(yīng)，均擴(kuò)增了長度為1 719 bp的特異的DNA條帶。進(jìn)一步取第一次PCR反應(yīng)產(chǎn)物最為模板，用Nested-PCR擴(kuò)增了長度為640 bp的特異DNA條帶，從而確保了該P(yáng)CR診斷空腸彎曲菌感染的特異性和靈敏性。該P(yáng)CR實(shí)驗(yàn)結(jié)果清晰，操作簡便，于24小時(shí)內(nèi)即可獲得檢測結(jié)果。建議該Nested-PCR方法推廣使用。

[1] GB14926-2001.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物等級(jí)及監(jiān)測[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2011-06-16.

[2] 何蕊，黃金林，許海燕，等.彎曲菌多重PCR檢測方法的建立及其初步應(yīng)用[J].揚(yáng)州大學(xué)報(bào)，2007，28（1）：5-8.

[3] 王振國，劉金華，羅燕菲，等. 應(yīng)用PCR技術(shù)檢測空腸彎曲菌及結(jié)腸彎曲菌的研究[J].中國家禽，2005，9（1）：133-135.

[4] Neubauer C，Hess M.Detection and identification of foodborne pathogens of the genera Campylobacter，Arcobacter and Helicobacter by multiplex PCR in poultry and poultry products[J].J Vet Med B Infect Dis Vet Public Health，2006，53（8）：376-381.

[5] Ronner A C，Lindmar k H.Quantitative Detection of Campylobacter jejuni on Fresh Chic k en Carcasses by Real-Time PCR[J].Journal of Food Protection，2007，70（6）：1373-1378.

[6] 高正琴，張強(qiáng)，邢進(jìn)，等. 空腸彎曲菌套式PCR快速檢測方法的建立與初步應(yīng)用[J].中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2006，16（12）：727-730.