楊宗照，王劍峰，謝 正，李洪洲 ，陳 陽(yáng)

（1.杭州市畜牧獸醫(yī)局，浙江杭州 310020；2.杭州市原種場(chǎng)，浙江杭州 3111153；3.杭州市蕭山區(qū)畜牧獸醫(yī)局，浙江杭州 311203）

豬瘟（classical swine fever，CSF）是由豬瘟病毒（CSFV）引起的一種急性、發(fā)熱性、高度接觸性傳染病，可導(dǎo)致各年齡豬發(fā)病。CSFV為黃病毒科瘟病毒屬有囊膜的正鏈RNA病毒。豬瘟因其流行程度高和致死率高，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了嚴(yán)重?fù)p失。OIE將其列為必須通報(bào)的傳染病。我國(guó)將其定為一類(lèi)傳染病。

1955年我國(guó)研制出的具有良好免疫效果的豬瘟兔化弱毒株疫苗應(yīng)用至今，對(duì)世界范圍內(nèi)豬瘟疫情的控制做出了重大貢獻(xiàn)，目前我國(guó)對(duì)豬瘟實(shí)行強(qiáng)制免疫政策。近年來(lái)，CSFV流行毒株在抗原性及毒力方面發(fā)生變異[1]，根據(jù)E2和NS5B的基因，目前共分為3個(gè)主型，10個(gè)亞型，即1.1-1.3、2.1-2.3、3.1-3.4亞型[2]。許多國(guó)家流行的豬瘟在臨床癥狀和病理變化方面均出現(xiàn)了新變化，出現(xiàn)了典型豬瘟和非典型豬瘟共存、持續(xù)感染和隱性感染共存等新特點(diǎn)[3-5]，豬瘟、藍(lán)耳病等疾病混合感染的情況也逐漸增多。豬瘟病理變化不具典型性，且多種病毒混合感染現(xiàn)象日益突出，這些都增加了豬瘟診斷及防控的難度。

國(guó)內(nèi)傳統(tǒng)的CSF診斷方法包括免疫熒光試驗(yàn)、病毒分離培養(yǎng)、動(dòng)物接種試驗(yàn)、新城疫病毒強(qiáng)化試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA） 、血清學(xué)試驗(yàn)等，為CSF的鑒定和診斷提供了有效的手段。但這些方法在特異性、敏感性以及時(shí)效性等方面都有各自的不足，不適用于CSFV感染的早期快速診斷。近年來(lái)，分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)，尤其是RT-PCR技術(shù)發(fā)展迅速，使豬瘟的檢測(cè)變得快速、準(zhǔn)確，本文主要對(duì)豬瘟強(qiáng)、弱毒株通用的RT-PCR檢測(cè)技術(shù)作以綜述，以期為CSFV檢測(cè)及防控工作提供參考。

1 豬瘟病毒的基因結(jié)構(gòu)

CSFV基因組長(zhǎng)約12.5 k b，僅含有一個(gè)大的開(kāi)放性閱讀框架（ORF），ORF兩側(cè)是5'端非翻譯區(qū)（5'UTR）和 3'端非翻譯區(qū)（3'UTR），且5'-端無(wú)帽子結(jié)構(gòu)，3'-端無(wú) poly（A）尾巴。ORF翻譯成含3 898個(gè)氨基酸殘基，分子質(zhì)量約438 k u的多聚蛋白，并進(jìn)一步在病毒和宿主細(xì)胞蛋白酶的作用下加工為成熟蛋白，CSFV的所有結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白均由該ORF所編碼。前體蛋白以共翻譯和后翻譯的形式在細(xì)胞蛋白酶和病毒特異蛋白酶作用下，加工成結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白，病毒RNA上的編碼結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白的順序?yàn)?Npro、C、Erns（E0）、E1、E2、P7、NS2-3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B（圖1），部分基因別名（表1）。NS2-3 可被加工成 NS2、NS3，除C、E0、E1和E2為結(jié)構(gòu)蛋白外，其余均為非結(jié)構(gòu)蛋白，最具有免疫防制研究?jī)r(jià)值的是 E0和E2。其中E2構(gòu)成了CSFV的主要免疫原，與牛病毒性腹瀉（BVDV）以及羊邊界病毒（BDV）都存在較強(qiáng)的交叉免疫反應(yīng)。

表 1 豬瘟病毒部分基因的別名

基因序列分析發(fā)現(xiàn)弱毒疫苗株HCLV與強(qiáng)毒株Shimen的E2基因主要抗原編碼區(qū)序列中分別有10個(gè)和16個(gè)限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，可用來(lái)鑒別兩種毒株[7]。豬瘟典型毒株有Alfort、石門(mén)毒株（Shimen）、Brascia、Alfort、豬瘟兔化弱毒疫苗C株（HCLV）等。

2 普通RT-PCR

普通RT-PCR是最早采用的技術(shù)，在RT-PCR結(jié)束后需要電泳拍照。最早是普通單重RT-PCR，即一次只檢測(cè)一種病原，后來(lái)產(chǎn)生了普通多重RT-PCR，即一次可以檢測(cè)出兩種及以上的病原。

2.1 單重 PCR

2.1.1 兩步法

傅烈振針對(duì)CSFV 5'端非編碼區(qū)設(shè)計(jì)了引物，擴(kuò)增產(chǎn)物為194 bp的兩步法RT-PCR檢測(cè)方法。其引物為 P1：5'-CCATGCCCATAGTAGGACTAGC-3'（正向引物，88~109 nt，Alfort）；P2： 5'-ATGTGATTTCACC CTAGCGACC-3'（反向引物，261~282 nt，Alfort）。喬軍設(shè)計(jì)了引物：TC（GA）（AT）CAACCAA（TC）GAGATAGGG（X87939 Alfort，2 477-2 497 nt）；CACAG（CT）CC（AG）AA（TC）CC（AG）AAGTCATC（X87939 Alfort，2 748-2 726 nt），建立了擴(kuò)增產(chǎn)物為272 bp的RT-PCR方法，這被農(nóng)業(yè)部2007年制定的《豬瘟防治技術(shù)規(guī)范》所采用。

劉建柱對(duì)豬瘟RT-PCR診斷方法與兔體交叉試驗(yàn)診斷方法的相關(guān)性進(jìn)行了研究。通過(guò)計(jì)算機(jī)軟件設(shè)計(jì)了針對(duì)豬瘟病毒E2基因保守區(qū)的1對(duì)引物（5'-CAGGTATGCGATCTCGTCAACCA-3'，5'-GGGCA CAGCCCAAATCCGAAGT-3'），建立豬瘟病毒RTPCR檢測(cè)方法，同時(shí)應(yīng)用兔體交叉試驗(yàn)進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果表明，二者的符合率為 100%，但RT-PCR可大大降低檢測(cè)所用的時(shí)間，更便于豬瘟的快速診斷。該方法僅應(yīng)用于7份臨床送檢病例，樣品數(shù)如能擴(kuò)大，結(jié)論更具有說(shuō)服力。

賈赟參考豬瘟兔化弱毒C株E2區(qū)基因和豬藍(lán)耳病病毒的基因序列，各設(shè)計(jì)了引物，豬瘟上游引物： 5'-CGCGTCGACCGA TACTTGGCATCATTG-3'，下游引物：5'-AACCTGCAGCCCCAACTTACAG TAGA-3'，產(chǎn)物長(zhǎng)375 bp。周斌對(duì)賈赟建立的檢測(cè)豬瘟、藍(lán)耳病的方法的檢測(cè)對(duì)象進(jìn)行了拓展，對(duì)江蘇、浙江等省市的17個(gè)大中型豬場(chǎng)送檢的186份種公豬精液樣品進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果24份樣品呈CSFV陽(yáng)性，其中有11份為PRRSV和CSFV的混合感染，約占送檢精液樣品的5.91%。試驗(yàn)結(jié)果表明，所建立的RT-PCR方法可用于精液中這2 種野毒感染的快速鑒定和分子流行病學(xué)調(diào)查。該方法能夠同時(shí)檢測(cè)豬瘟和藍(lán)耳病，因此實(shí)用價(jià)值比較大。

俞伏松[8]參照CSFV NS3基因序列，設(shè)計(jì)上游引物（HCV1）：5'- GCTCCTGGTTGGTAACCTCGG-3'位于基因組的5 076~5 096位；下游引物（HCV2）：5'- TGATGCTGTCACACAGGTGAA- 3'位于基因組的5 584~5 564 位，預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為509 bp。應(yīng)用RT- PCR以CSFV兔化弱毒株RNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，獲得與預(yù)期大小相符特異性目的片段，敏感性達(dá)到10 pg CSFV-RNA；15份臨床疑似病料應(yīng)用RT-PCR的檢出率（66.7%）與直接熒光抗體試驗(yàn)（DFA）的檢出率（60.0%）總符合率為80%。表明RT-PCR方法比DFA更敏感，兩種方法均可用于豬瘟的快速診斷。

2.1.2 一步法

焦莉[9]針對(duì)豬瘟病毒5'端非編碼區(qū)保守序列設(shè)計(jì)了一對(duì)引物，5'-AAACGGAGGGACTAGCCGT-3'（上游引物 120~138 nt，Alfort 187），5'-GATTCAACTC CATGTGCCATG-3'（ 下 游 引 物 366~386 nt，Alfort 187），擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)267 bp，建立了檢測(cè)CSFV的一步法RT-PCR方法，該方法對(duì) 5 株CSFV擴(kuò)增結(jié)果均為陽(yáng)性，對(duì)照毒株擴(kuò)增結(jié)果均為陰性；對(duì)CSFV檢測(cè)的敏感性為 1.09×10-1ng總RNA量。

吳鑫[10]根據(jù)豬瘟病毒石門(mén)毒株的E2 基因序列，設(shè)計(jì)合成了1 對(duì)檢測(cè)豬瘟病毒E2 基因的RTPCR引物。上游引物Pf：5'-CAGGTATGCGATC TCGTCAACCA-3'，下游引物Pr：5'-GGGCACAGCCC AAATCCGAAGT-3'，預(yù)期擴(kuò)增的片段大小267 bp。建立了豬瘟病毒E2基因RT-PCR 檢測(cè)方法，應(yīng)用建立的方法從26份疑似豬瘟病料中檢出陽(yáng)性病料24份，陽(yáng)性檢出率為92.3%；結(jié)果表明，建立的RT-PCR 方法具有良好的特異性和敏感性，可用于CSFV臨床病料的檢測(cè)和分子流行病學(xué)調(diào)查。

2.1.3 巢式RT-PCR

朱小甫[11]根據(jù)Shimen 株（AF092448）基因序列設(shè)計(jì)了 2 對(duì)引物。P1：5'-GTAACTGGGGCACAAGG-3'，P2：5'-TTATCACTATCAGCCACAGGACAT-3'，PED1：5'-TCGACAACCAATGAGATAGGG-3'，PED2：5'-CACAGCCCAAATCCAAAGTCATC-3'，預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為272 bp。優(yōu)化了豬瘟病毒（CSFV）的RT-nested PCR 檢測(cè)方法，并對(duì)所優(yōu)化的RT-nested PCR 特異性進(jìn)行了檢驗(yàn)。結(jié)果表明，該方法檢測(cè)CSFV cDNA含量的最低極限為1×10-7ng/mL，特異性強(qiáng)。應(yīng)用此方法對(duì)福建省133 份病料進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果有60 份病料為陽(yáng)性，陽(yáng)性率為45.1%。結(jié)果提示優(yōu)化的檢測(cè)方法靈敏度高，特異性強(qiáng)。

2.2 多重 PCR

隨著養(yǎng)豬業(yè)規(guī)?；陌l(fā)展，混合感染逐漸增多，豬瘟與藍(lán)耳病的混合感染最為常見(jiàn)，因此設(shè)計(jì)多種病原同時(shí)檢測(cè)的多重RT-PCR方法也應(yīng)運(yùn)而生。 建立多重PCR 檢測(cè)方法有許多需要注意的地方： 在引物的設(shè)計(jì)與選擇方面，要注意引物二聚體的形成；在選擇反應(yīng)條件時(shí)，要注意各引物與模板的比例及退火溫度的選擇，反應(yīng)條件要有利于片段較小的一方等。同時(shí)注意各擴(kuò)增片段的大小，以便在瓊脂糖凝膠電泳中能清晰分開(kāi)。

劉建柱根據(jù)CSFV E2基因、豬細(xì)小病毒（PPV）VP2基因和豬偽狂犬病病毒（PRV） gⅡ基因的保守序列，分別設(shè)計(jì)3對(duì)引物。用這 3 對(duì)引物優(yōu)化后，得到3條與試驗(yàn)設(shè)計(jì)相符的288 bp（CSFV）、575 bp（PPV） 和700 bp（PRV） 特異性條帶，敏感性檢測(cè)結(jié)果表明，該多重PCR可以檢測(cè)到14.5 ng/L的CSFV核酸模板。針對(duì)CSFV的上下游引物分別為：5'-CAGGTATGCGATCTCGTCAACCA-3'，5'-GGGCAC AGCCCAAATCCGAAGT-3'。

豬瘟、藍(lán)耳病和流行性乙型腦炎都可引起種豬繁殖障礙，劉輝[12]根據(jù)豬瘟病毒的E2 基因保守序列，藍(lán)耳病病毒的ORF7及部分ORF6 和3'-UTR和豬乙型腦炎病毒的E基因保守序列，設(shè)計(jì)了3 對(duì)引物，建立了同時(shí)檢測(cè)豬瘟、藍(lán)耳病、乙型腦炎的多重RTPCR。薛媛[13]根據(jù)JEV的E 基因保守序列，并參考羅廷榮所使用的CSFV引物，建立檢測(cè)CSFV、JEV的復(fù)合RT-PCR方法。

劉杉杉[14]為建立同時(shí)檢測(cè)豬捷申病毒（PTV）、豬瘟病毒（CSFV）和豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）的多重RT-PCR （mRT-PCR）檢測(cè)方法，以 CSFV Erns 基因、PRRSV ORF6 基因和 PTV 5'-UTR基因?yàn)閷?duì)象，建立檢測(cè)3種病毒的 mRT-PCR 方法。CSFV 的最低核酸檢出量為7.81×103拷貝，略低于單一RT-PCR 敏感性；應(yīng)用該方法對(duì)69份送檢樣品進(jìn)行檢測(cè)，其中PRRSV和CSFV混合感染檢出率為4.35%，CSFV 和 PTV 的混合感染檢出率為13.04%，3 種病毒的混合感染檢出率為 8.70%，該方法對(duì)臨床早期診斷和流行病學(xué)調(diào)查具有重要意義。

豬也可能感染與同屬的BVDV、BDV，Díaz[15]建立了一種區(qū)分它們的RT-PCR方法，擴(kuò)增的靶序列為NS5B區(qū)，敏感度可達(dá)0.89TCID50。缺點(diǎn)是擴(kuò)增的片段只有174 bp，在電泳后條帶不易與引物二聚體區(qū)分，使用該方法的引物對(duì)擴(kuò)增過(guò)程稍加改進(jìn)或許可以成為熒光定量方法。

Jiang[16]建立了一種同時(shí)檢測(cè)豬瘟、藍(lán)耳、偽狂犬、圓環(huán)病毒的多重RT-PCR方法，其優(yōu)點(diǎn)是可以同時(shí)檢測(cè)多重病原，缺點(diǎn)是其敏感度不高，對(duì)CSFV的最低檢出限為 2.66×107拷貝 /μL。

Xu[17]建立了一種兩步法檢測(cè)豬瘟、藍(lán)耳、乙腦、圓環(huán)病毒2型、偽狂犬、細(xì)小病毒等6種病原的多重RT-PCR方法，其中豬瘟等RNA病毒核酸在經(jīng)過(guò)RT生成cDNA后，與偽狂犬等DNA病毒的DNA一起進(jìn)行PCR。該法節(jié)省了時(shí)間，通過(guò)初步試驗(yàn)，與單重的結(jié)果一致。如果能夠進(jìn)一步檢測(cè)大量樣本，結(jié)果與單重方法符合率較高，那么該方法具有廣闊的應(yīng)用前景。

3 熒光定量RT-PCR

近年發(fā)展起來(lái)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR （realtime fl uorescent quantitative PCR，F(xiàn)Q-PCR） 技術(shù)能快速檢測(cè)極微量的病毒核酸，而且能準(zhǔn)確確定樣品中病毒的拷貝數(shù)，操作方便，耗時(shí)短，結(jié)果直觀，因而迅速在醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。

3.1 單重?zé)晒舛?/p>

Pérez[18]設(shè)計(jì)了SYBR法檢測(cè)豬瘟，其擴(kuò)增區(qū)在豬瘟的NS5B區(qū)，該方法對(duì)不同樣品的敏感度有所不同，如血清、組織樣品分別是10，100拷貝/μL。李軍[19]根據(jù)豬瘟病毒基因組5'UTR基因序列設(shè)計(jì)引物（5'-GCCCATAGTAGGACTAGCA-3'；5'-CGAACTACTGACGACTGTC-3'），建立了一個(gè)用于豬瘟病毒快速定量檢測(cè)的SYBR Green 熒光定量RT-PCR方法，最小檢出量為2×102病毒基因組拷貝數(shù)。

表 2 以5'UTR端設(shè)計(jì)的檢測(cè)豬瘟的單重?zé)晒舛糠椒?/p>

袁雪梅[20]根據(jù)豬瘟病毒 （CSFV）5'UTR，設(shè)計(jì)豬瘟病毒特異性的引物和探針，建立了基于SYBR Green和TaqMan探針的兩種熒光定量PCR檢測(cè)方法。兩種方法對(duì)豬瘟病毒C株的檢測(cè)下限均為10TCID50，均高于常規(guī)的套式 PCR。用攜帶該基因片段的重組質(zhì)粒為模板進(jìn)行檢測(cè)，SYBR Green方法的檢測(cè)下限為 3×100拷貝，比TaqMan探針?lè)椒ǜ屿`敏 （3×101拷貝）。進(jìn)一步應(yīng)用 SYBR Green方法對(duì)不同感染階段細(xì)胞內(nèi)病毒 RNA 復(fù)制水平進(jìn)行檢測(cè)，與病毒滴度的結(jié)果基本一致。該研究建立的 SYBR Green I熒光定量PCR檢測(cè)方法能夠應(yīng)用于組織和培養(yǎng)細(xì)胞中豬瘟病毒的檢測(cè)。

陳玉棟針對(duì)豬瘟病毒兔化弱毒疫苗株HCLV 序列（AF091507）的 5'UTR設(shè)計(jì)引物和探針，建立了定量檢測(cè)豬瘟兔化弱毒疫苗株的熒光定量RT-PCR方法。其靈敏度為102拷貝，線性范圍為107~102，對(duì)9份疫苗樣品進(jìn)行了檢測(cè)，與兔體定型熱反應(yīng)方法相比較，有很好的相關(guān)性。該法為豬瘟病毒分子生物學(xué)研究提供了一種新的、簡(jiǎn)捷有效的工具。鄧力也設(shè)計(jì)了針對(duì)HCLV的5'UTR使用探針的FQ-PCR方法，敏感，其靈敏度為10拷貝/μL。

劉大偉[21]為建立一種快速鑒定豬瘟兔化弱毒疫苗株（HCLV）的方法，在Erns基因序列區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)引物和TaqMan 探針，即P1：5'-GCGGCAGTTTACTCCAGGAC-3'；P2： 5'-CCAACCTCTCTTCCCGCAGTG-3'，熒 光 探針 FP：Fam-5'-TGCCTCCCGAGCCAAGATGTCACC-3'–Eclipse）。該方法檢測(cè)的靈敏度可達(dá) 3.84拷貝 /μL；分別用經(jīng)典的兔檢法測(cè)定兔體感染量（RID）和新建立的FQ RT-PCR方法進(jìn)行比較檢測(cè)，兩者有較好的相關(guān)性。

王云龍[4]也設(shè)計(jì)了針對(duì)5'UTR的TaqMan探針，建立了檢測(cè)豬瘟的FQ-PCR方法，該方法檢測(cè)靈敏度可達(dá) 1.0×100拷貝/μL，線性范圍為 109~100。還有王榮、李安、馬琳、任夫波等根據(jù)豬瘟5'UTR設(shè)計(jì)了熒光定量方法（表2）。

Wen[22]建立了MGB探針一步法檢測(cè)豬瘟的方法，一般情況下，該方法比病毒分離敏感10倍，與病毒分離符合率76.7%。

總之，這些方法以針對(duì)5'UTR設(shè)計(jì)的方法居多，在選擇時(shí)，首先可選SYBR方法，因?yàn)樗拿舾行员容^高，成本比探針?lè)ǖ?。其次在使用時(shí)如果遇到檢測(cè)結(jié)果可疑的情形，最好選用靶序列不同的方法，如針對(duì)5'UTR 的方法和針對(duì)NS5B的 FQ-PCR方法。

3.2 多重?zé)晒舛?/p>

Huang[2]使用Taqman探針建立了同時(shí)檢測(cè)CSFV 3個(gè)亞型的方法，與以前的擴(kuò)增后測(cè)序定型相比，節(jié)省了大量的時(shí)間。

牛偉[23]根據(jù)豬瘟病毒E2和豬繁殖與呼吸綜合征病毒ORF5的序列設(shè)計(jì)2對(duì)特異性引物，建立了一種快速檢測(cè)CSFV和PRRSV的SYBR Green 實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法。豬瘟上游引物：5'-CGAGTCCTGTTGTCAA GGG-3'，下游引物：5'-AG TTGTTGGGCTCACTGCT-3'。

Cheng[24]使用Taqman探針建立了同時(shí)檢測(cè)美洲型PRRS和CSFV的方法，其引物位置在藍(lán)耳病的ORF7、CSFV的5'UTR。對(duì)豬瘟的敏感度為3.2TCID50或13 RNA拷貝，是一種敏感度相當(dāng)高的方法。

4 各種方法的優(yōu)缺點(diǎn)

4.1 普通RT-PCR與熒光定量RT-PCR

普通RT-PCR方法具有成本低，儀器設(shè)備、耗材便宜等優(yōu)點(diǎn)，不便之處是需要開(kāi)管操作還需要電泳、拍照等后續(xù)步驟，熒光定量方法省去了后續(xù)操作，更加快捷，省力，而且可以定量，但是需要的儀器耗材較貴，成本較高。

4.2 SYBR與探針熒光定量方法的優(yōu)缺點(diǎn)

使用探針?lè)ㄟ€比較容易設(shè)計(jì)多重RT-PCR，同時(shí)檢測(cè)多種病原。探針?lè)▽?duì)序列的變化非常敏感，因此，趙建軍等設(shè)計(jì)兩條只差一個(gè)堿基的探針即能同時(shí)快速區(qū)分豬瘟兔化弱毒苗和豬瘟野毒，具有很高的特異性。但是對(duì)于變異大的病原可能產(chǎn)生假陰性，探針的成本也較高。 SYBR法設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，可以設(shè)計(jì)兼并引物，對(duì)于有些變異的病原照樣可以檢測(cè)，成本也不高，普通的熒光定量?jī)x器均可滿足需要，但是在設(shè)計(jì)多重FQPCR時(shí)有較高難度。

4.3 熒光定量標(biāo)準(zhǔn)品的問(wèn)題

應(yīng)用FQ RT-PCR方法檢測(cè)RNA病毒，通常用體外轉(zhuǎn)錄的RNA片段作為標(biāo)準(zhǔn)品，Hoffmann等提出用體外轉(zhuǎn)錄的 CSFV RNA 片段作為標(biāo)準(zhǔn)品可消除因RNA 提取和反轉(zhuǎn)錄效率帶來(lái)的實(shí)驗(yàn)誤差。但體外轉(zhuǎn)錄的 RNA 作為標(biāo)準(zhǔn)品易降解，并且每次實(shí)驗(yàn)前需重新稀釋定量，不能真實(shí)代表單鏈 RNA 病毒感染樣品中負(fù)鏈和正鏈 RNA 的比例。采用已知滴度的CSFV石門(mén)株血毒總RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物后作為標(biāo)準(zhǔn)品，雖可較精確用于臨床樣品的定量，但每次實(shí)驗(yàn)均需要制備標(biāo)準(zhǔn)品，而且存在病毒擴(kuò)散的危險(xiǎn)性。標(biāo)準(zhǔn)品采用質(zhì)粒 DNA 可能存在轉(zhuǎn)錄效率問(wèn)題，Hayward 等認(rèn)為對(duì)不同目的片段RNA 的反轉(zhuǎn)錄效率相差很大，但對(duì)于同一個(gè)靶片段而言，其反轉(zhuǎn)錄效率穩(wěn)定 。劉大偉[21]也證實(shí)了采用質(zhì)粒DNA作為標(biāo)準(zhǔn)品具有穩(wěn)定、易于標(biāo)準(zhǔn)化的優(yōu)點(diǎn)。

4.4 兩步法的優(yōu)點(diǎn) 針對(duì)RNA 病毒的反轉(zhuǎn)錄采用隨機(jī)引物進(jìn)行擴(kuò)增，這樣對(duì)于幾種RNA 病毒混合感染的樣品來(lái)說(shuō)，一次反轉(zhuǎn)錄就可以解決幾個(gè)病毒反轉(zhuǎn)錄的問(wèn)題，極大地節(jié)約了時(shí)間。

5 檢測(cè)部位的選擇和其它注意事項(xiàng)

吳鑫[10]發(fā)現(xiàn)同一只病豬的不同內(nèi)臟器官的RTPCR 結(jié)果并不相同。淋巴結(jié)的檢出率要明顯高于其他臟器，大致排序?yàn)椋?淋巴結(jié)>脾臟>腎臟>肺臟>肝臟。這可能與不同病程病毒復(fù)制的部位及不同臟器提取RNA 的難易程度有關(guān)。如肝臟中富含內(nèi)源性RNase，在提取肝臟RNA 時(shí)，就更容易發(fā)生RNA降解，從而導(dǎo)致RT-PCR失敗。

夏芳用所建立的熒光定量 PCR 方法檢測(cè)出的樣品數(shù)據(jù)，免疫豬后組織內(nèi)病毒主要分布在血液、脾臟、淋巴結(jié)、扁桃體、腹股溝淋巴結(jié)中，其它部位未見(jiàn)有病毒分布。應(yīng)采集扁桃體、脾、腎、肺和回腸末段。扁桃體是豬瘟病毒（CSFV）感染后最先能檢測(cè)出病毒抗原的組織，因而扁桃體是急性病例的首選病料。回腸末段則是慢性病例的首選病料。病料應(yīng)從多個(gè)病豬采集。對(duì)于活豬而言，血液和扁桃體的刮取物是比較好的CSFV檢測(cè)樣本。在血液中的檢出率：強(qiáng)毒株在3~8 dpi、中毒株在5~28 dpi接近100%，弱毒株在5~21 dpi時(shí)檢出率在27%~70%[25-26]。肌肉和血清中的檢出率比較一致，但因?yàn)闄z出率較低，因此絕對(duì)不是檢測(cè)CSFV的首要選擇。

采集的病料不加防腐劑、置低溫環(huán)境（冰盒）中，盡快送到實(shí)驗(yàn)室檢。Weesendorp[27]的研究表明，不具備低溫運(yùn)輸條件時(shí)，扁桃體和脾臟比腎臟、腸系膜淋巴結(jié)更合適。

精液稍顯特殊，其中含有較多的蛋白，因此需要一些前處理：將其與 PBS（0.01 mol/L，pH 7.4）按1:9混合均勻，反復(fù)凍融3次破壞其蛋白成分，4 ℃ 12 000 r /min離心10 min，棄蛋白沉淀。取上清 500 μL，加入800 μL Trizol后按常規(guī)方法提取RNA，其中氯仿抽提需 2次，盡量將精液中的剩余蛋白去除干凈。

隨著技術(shù)的發(fā)展，不斷產(chǎn)生了針對(duì)CSFV的新的RT-PCR檢測(cè)方法，在使用不同的檢測(cè)方法時(shí)，不同的反轉(zhuǎn)錄酶和反轉(zhuǎn)錄隨機(jī)引物對(duì)敏感度可能有一定的影響，需要引起注意。

6 展望

豬瘟作為國(guó)家非常重視的一類(lèi)動(dòng)物疫病，疫苗的應(yīng)用非常普遍，一般情況下，肉豬需要免疫兩次。據(jù)報(bào)道，國(guó)內(nèi)使用的豬瘟疫苗免疫一次后在豬血液和扁桃體中的豬瘟病毒核酸檢出時(shí)間（熒光定量法）分別達(dá)28天和42天，因此建立的CSFV通用型RTPCR檢測(cè)方法對(duì)于未免疫生豬豬瘟病的確診完全沒(méi)有問(wèn)題，但是對(duì)于免疫后發(fā)病豬的檢測(cè)，需要使用鑒別RT-PCR或者配合發(fā)病前后的抗體檢測(cè)才能進(jìn)行豬瘟確診。

豬瘟檢測(cè)的趨勢(shì)是自動(dòng)化和快速并最好同時(shí)能夠區(qū)分野毒和疫苗株，在本文列舉的方法中，多重?zé)晒舛糠椒▽⑹俏磥?lái)研究和應(yīng)用的主流。

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