曹 振，鄧小雨，張 倩，倪建強，周 智，遇秀玲，趙德明，田克恭

（1.中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，中國北京 100193；2.中國動物疫病預防控制中心，中國北京 100125）

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起豬的一種高度接觸性傳染病，不同年齡、品種和性別的豬均能感染。按臨床表現(xiàn)的不同，可分為經(jīng)典PRRS和高致病性PRRS。經(jīng)典PRRS自1987年首次在美國暴發(fā)以來，現(xiàn)已遍及全球各養(yǎng)豬業(yè)發(fā)達的國家和地區(qū)[1-2]，并在上世紀90年代傳入我國[3-4]，臨床上以妊娠母豬流產(chǎn)、早產(chǎn)、產(chǎn)死胎和木乃伊胎等生殖障礙以及各年齡段豬出現(xiàn)呼吸道癥狀和仔豬斷奶前死亡率升高為特征[5-6]。高致病性PRRS于2006年在我國首次暴發(fā)[7]，現(xiàn)已蔓延至越南、老撾、泰國等東南亞國家，臨床上以高度接觸性傳播、全身出血、肺部實變和母豬繁殖障礙為特征，仔豬、育肥豬和成年豬均可發(fā)病和死亡，其中仔豬發(fā)病率可達100%，死亡率可達50%以上，母豬流產(chǎn)率可達30%以上。

對PRRSV單克隆抗體的研究可為PRRSV快速檢測方法的建立提供技術(shù)支持，是PRRS研究中的熱點之一。本研究采用純化的PRRSV全病毒作為抗原，通過淋巴細胞雜交瘤技術(shù)，獲得了高親和力、高特異性抗PRRSV M蛋白的單克隆抗體，并對單克隆抗體的生物學特性進行了鑒定，為建立基于單克隆抗體的雙抗體夾心ELISA、間接免疫熒光試驗、膠體金試紙條等快速檢測技術(shù)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 毒種和細胞

PRRSV HUB1毒株、Marc-145細胞、小鼠骨髓瘤SP2/0細胞由中國動物疫病預防控制中心保存。

1.2 主要試劑

DMEM培養(yǎng)基購自GIBCO公司；HAT、HT、PEG1450、弗氏完全和不完全佐劑購自Sigma公司；羊抗鼠IgG（HRP標記）購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；胎牛血清購自BIOCHROM公司；免疫球蛋白分型檢測試劑盒（SBA Clonotyping System/AP kit）購自Southern Biotech公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自Pierce公司；PRRSV抗體檢測試劑盒購自LSI公司；豬瘟病毒（CSFV）、豬偽狂犬病毒（PRV）抗體檢測試劑盒購自IDEXX公司；豬細小病毒（PPV）、豬圓環(huán)病毒（PCV）抗體檢測試劑盒購自北京測迪科技有限公司。

1.3 試驗動物

SPF級BALB/c小鼠購自中國藥品生物制品檢定所實驗動物中心[SCKK（京2005-2004）]。

1.4 PRRSV增殖和純化

將PRRSV接種于Marc-145細胞單層，待70%以上細胞出現(xiàn)病變時收獲病毒，反復凍融處理3次，經(jīng)4 ℃ 5000 r/min離心30 min收集上清，再經(jīng)40000 r/min超速離心150 min濃縮病毒，用適量PBS浮懸沉淀，測其蛋白含量和病毒TCID50滴度，置-70 ℃保存。

1.5 動物免疫

用純化的PRRSV蛋白與等體積弗氏完全佐劑乳化均勻后，腹腔及背部皮下多點注射6～8周齡雌性BALB/c小鼠，100 μg/只；2周后用弗氏不完全佐劑進行第二次免疫，間隔2周第三次加強免疫；最后一次免疫2周后采血測血清抗體效價，待效價達1:105以上時進行細胞融合。融合前3天，用100 μg不加佐劑的抗原液進行加強免疫。

1.6 雜交瘤細胞的制備和篩選

將對數(shù)生長期的SP2/0細胞和免疫BALB/c小鼠脾細胞按1:10比例在50%聚乙二醇（PEG1450）作用下按文獻[8]進行細胞融合。融合后細胞用HAT完全培養(yǎng)液懸浮，加入鋪有飼養(yǎng)細胞的96孔細胞培養(yǎng)板中，100 μL/孔，置37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用間接ELISA和免疫過氧化物酶單層試驗（IPMA）方法對培養(yǎng)上清進行篩選檢測，選取OD值高、IPMA顯色較深、生長良好且不與正常Marc-145細胞反應的陽性細胞孔，以有限稀釋法克隆3次，使克隆孔陽性率達到100%。將篩選的強陽性單克隆細胞進行擴大培養(yǎng)以制備腹水，并將一部分細胞連續(xù)傳代、凍存，觀察細胞分泌單克隆抗體的穩(wěn)定性。

1.7 腹水單克隆抗體的制備及純化

選擇10～12周齡BALB/c小鼠，每只腹腔注射滅菌液體石蠟0.5 mL；2～3周后腹腔接種雜交瘤細胞（0.5～1×106個細胞/只），待小鼠腹部明顯膨大時采集腹水，3000 r/min離心10 min，腹水上清用親和層析法純化，測其蛋白含量和抗體效價，-20℃保存。

1.8 單克隆抗體特性鑒定

1.8.1 單克隆抗體類及亞類鑒定

按照免疫球蛋白分型檢測試劑盒說明書進行單克隆抗體類及亞類測定。

1.8.2 單克隆抗體ELISA效價測定

將單克隆抗體細胞上清或腹水10倍系列稀釋后，按間接ELISA操作流程進行抗體效價測定。

1.8.3 單克隆抗體IPMA效價的測定

將PRRSV接種Marc-145細胞，待75%細胞出現(xiàn)細胞病變時收獲細胞并進行抗原片制備，同時制備正常Marc-145細胞作為對照，將單克隆抗體細胞上清或腹水系列倍比稀釋后，按IPMA常規(guī)方法進行檢測、顯微鏡觀察結(jié)果。

1.8.4 單克隆抗體分泌穩(wěn)定性測定

將雜交瘤細胞連續(xù)傳代3個月及液氮凍存后復蘇，取培養(yǎng)上清檢測其抗體ELISA效價，以SP2/0細胞培養(yǎng)液作陰性對照。

1.8.5 單克隆抗體的抗原位點識別分析

將提純的PRRSV蛋白和Marc-145細胞對照蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜（NC）上用單克隆抗體進行蛋白免疫印跡（Western-Blotting）分析。

1.8.6 單克隆抗體特異性鑒定

將單克隆抗體用購買的PRRSV、CSFV、PRV、PPV、PCV抗體ELISA檢測試劑盒（二抗為HRP標記的羊抗鼠IgG）進行檢測，以SP2/0腹水作陰性對照。

2 結(jié)果

2.1 PRRSV提純抗原蛋白含量和TCID50效價測定

用蛋白定量試劑盒測定純化后PRRSV蛋白含量為7.15 mg/ mL，病毒滴度為108.0TCID50/mL。

2.2 雜交瘤細胞株的建立

經(jīng)間接ELISA篩選和IPMA鑒定，3次亞克隆后獲得了2株穩(wěn)定分泌PRRSV抗體的雜交瘤細胞，命名為3C3、3D2。該細胞株具有雙親代的生物學性質(zhì)，腹腔接種BALB/c小鼠和體外連續(xù)傳代3個月均穩(wěn)定地產(chǎn)生特異性PRRSV抗體，將雜交瘤細胞凍存于液氮中，3個月、6個月、12個月后復蘇細胞生長良好，抗體分泌水平未見降低。

2.3 單克隆抗體類與亞類的鑒定

經(jīng)免疫球蛋白分型檢測試劑盒測定，3C3和3D2兩株雜交瘤細胞免疫球蛋白亞型均為IgG2a、kappa鏈。

2.4 單克隆抗體效價測定

2.4.1 單克隆抗體間接ELISA效價測定

用間接ELISA檢測其效價（表1），結(jié)果表明兩株單克隆抗體的細胞上清效價為103～104，腹水效價為105～107。

表1 單克隆抗體ELISA效價

2.4.2 免疫過氧化物酶單層試驗測定

將兩株單克隆抗體不同稀釋倍數(shù)用IPMA試驗進行檢測，以出現(xiàn)棕黃色至棕褐色判為陽性反應（表2、圖1）。結(jié)果，雜交瘤細胞培養(yǎng)上清的IPMA抗體效價在1:320以上，腹水的IPMA效價在1:2560以上。

表2 單克隆抗體IPMA效價

2.5 抗體結(jié)合位點分析

Western-blotting結(jié)果見圖2，從圖中結(jié)果可以看出兩株單克隆抗體針對的均為PRRSV 的M蛋白（約19KD）。

2.6 單克隆抗體特異性測定

間接ELISA結(jié)果顯示兩株單克隆抗體只與PRRSV反應，與CSFV、PRV、PPV、PCV均無交叉反應，說明兩株單克隆抗體具有良好的特異性。

3 討論

3.1 單克隆抗體的制備

抗原的純度是影響單克隆抗體成功制備的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，本研究以純化的全病毒蛋白為抗原制備單克隆抗體，并對其進行TCID50滴度測定。在免疫小鼠時，考慮到免疫途徑、免疫次數(shù)與間隔時間都會影響機體的免疫應答能力，我們設(shè)計了詳細的免疫程序，前三次免疫通過頸、背部皮下免疫，最后一次加強免疫采用腹腔和脾臟注射，使融合前小鼠的血清ELISA效價高達1:105以上，確保了融合效果。

3.2 單克隆抗體的篩選與鑒定

單克隆抗體篩選方法需要滿足快速、簡便，便于一次處理大量樣品等要求，我們用純化的PRRSV作為抗原建立了間接ELISA技術(shù)，一次可以檢測大量的細胞培養(yǎng)上清；同時，對ELISA陽性結(jié)果再用IPMA方法和商品化PRRSV抗體檢測試劑盒進行驗證，準確地篩選到兩株分泌抗PRRSV單克隆抗體的雜交瘤細胞。對獲得的兩株雜交瘤細胞進行鑒定，免疫球蛋白亞型均為IgG2a、kappa鏈。經(jīng)Westernblotting證明，所得的兩株單克隆抗體均針對PRRSV的M蛋白的單克隆抗體。Magar等[9]用單克隆抗體技術(shù)鑒定表面PRRSV M蛋白上存在四個連續(xù)的表位，兩個為美洲型PRRSV特異，一個為歐洲型分離株特異，還有一個在兩個基因型中都存在。之后，Yang等[10]制備了一株具有中和活性的M蛋白單克隆抗體，隨后又鑒定出了三個不連續(xù)性表位，并分別命名為EPORF6A-C，其中EPORF6A和B都可以作為中和抗體的靶標。在本研究中，我們獲得了兩株抗PRRSV M蛋白的單克隆抗體，為進一步研究M蛋白的抗原表位和中和活性奠定了基礎(chǔ)。

3.3 單克隆抗體的生物學特性鑒定

美洲型和歐洲型的PRRSV分離株之間，M蛋白是最保守的蛋白，位于病毒的囊膜上，是病毒主要結(jié)構(gòu)蛋白之一，是感染豬體液免疫的主要對象。研究分析表明，M蛋白是一種免疫原性很好的蛋白質(zhì)?？烧T導產(chǎn)生抗體反應，且在感染后10天即可檢出，因此，使用M蛋白作為抗原建立的診斷技術(shù)可用于檢測各型PRRSV引起的感染。

特異性實驗結(jié)果表明本研究獲得的兩株單克隆抗體只與PRRSV反應，與CSFV、PRV、PPV、PCV均無交叉反應；抗體效價檢測結(jié)果表明，單克隆抗體的腹水ELISA效價最高可達107，IPMA效價可達1:10240；兩株雜交瘤細胞經(jīng)凍存后復蘇，細胞生長良好，腹腔接種BALB/c小鼠后可致瘤，并穩(wěn)定分泌特異性抗體，為PRRS致病機制的研究和快速診斷試劑的開發(fā)（如膠體金診斷試紙條、免疫熒光檢測、ELISA檢測試劑盒）奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。

[1]Keffaber K K，Reproductive failure of unknown etiology [J].American Association of Swine Practitioners Newsletter，1989，1（2）：1-10.

[2]Dea S，Bilodeau R，Sauvageau R，et al.Virus isolations from farms in Quebec experiencing severe outbreaks of respiratory and reproductive problems[C].//Proc.Mystery Swine Dis Comm Meet Livest Consery Inst Denver Colo：1991，67-72.

[3]Chang C C，Chung W B，Lin M W，et al.Porcine reproductive and respiratory syndrome （PRRS） in Taiwan I [J]. J Chin Soc Vet Sci，1993，19（4）：268-276.

[4]郭寶清，陳章水，劉文興，等.從疑似PRRS流產(chǎn)胎兒中分離PRRSV的研究[J].中國畜禽傳染病，1996，87（2）：1-5.

[5]Bilodeau R，Dea S，Martineau GP，et al.Porcine reproductive and respiratory syndrome in Quebec [J].Vet Rec，1991，129（5）：102-103.

[6]Bautista EM，Meulenberg JJ，Choi CS，et a1.Structural

polypeptides of the American（VR-2332）strain of porcine reproductive and respiratory syndrome（PRRS） virus [J].Arch Virol，1996，141（7）：1357-1365.

[7]Tian K G，Yu X L，Zhao T Z，et al.Emergence of fatal PRRSV variants：unparalleled outbreaks of atypical PRRS in China and molecular dissection of the unique hallmark [J].PLo S ONE，2007，2（6）：e526-539.

[8]徐志凱.實用單克隆抗體技術(shù)[M].西安：陜西科學技術(shù)出版社，1992.

[9]Magar R，Larochelle R，Nelson EA，et al.Differential reactivity of monoclonal antibodies directed to the membrane protein of porcine rep roductive and respiratory syndrome virus[J].Can J Vet Res ，1997，61（1）：69-71.

[10]Yang L，F(xiàn)rey mL，Yoon KJ，et a1.Categorization of North American porcine reproductive and respirmory syndrome virus：epitopic profiles of the N，M，GP5 and GP3 proteins and susceptibility to neutrolization[J].Arch Virol，2000，145（8）：1599-1619.