曹 振，鄧小雨，張 倩，倪建強(qiáng)，周 智，遇秀玲，趙德明，田克恭

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，中國(guó)北京 100193；2.中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，中國(guó)北京 100125）

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起豬的一種高度接觸性傳染病，不同年齡、品種和性別的豬均能感染。按臨床表現(xiàn)的不同，可分為經(jīng)典PRRS和高致病性PRRS。經(jīng)典PRRS自1987年首次在美國(guó)暴發(fā)以來(lái)，現(xiàn)已遍及全球各養(yǎng)豬業(yè)發(fā)達(dá)的國(guó)家和地區(qū)[1-2]，并在上世紀(jì)90年代傳入我國(guó)[3-4]，臨床上以妊娠母豬流產(chǎn)、早產(chǎn)、產(chǎn)死胎和木乃伊胎等生殖障礙以及各年齡段豬出現(xiàn)呼吸道癥狀和仔豬斷奶前死亡率升高為特征[5-6]。高致病性PRRS于2006年在我國(guó)首次暴發(fā)[7]，現(xiàn)已蔓延至越南、老撾、泰國(guó)等東南亞國(guó)家，臨床上以高度接觸性傳播、全身出血、肺部實(shí)變和母豬繁殖障礙為特征，仔豬、育肥豬和成年豬均可發(fā)病和死亡，其中仔豬發(fā)病率可達(dá)100%，死亡率可達(dá)50%以上，母豬流產(chǎn)率可達(dá)30%以上。

對(duì)PRRSV單克隆抗體的研究可為PRRSV快速檢測(cè)方法的建立提供技術(shù)支持，是PRRS研究中的熱點(diǎn)之一。本研究采用純化的PRRSV全病毒作為抗原，通過(guò)淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，獲得了高親和力、高特異性抗PRRSV M蛋白的單克隆抗體，并對(duì)單克隆抗體的生物學(xué)特性進(jìn)行了鑒定，為建立基于單克隆抗體的雙抗體夾心ELISA、間接免疫熒光試驗(yàn)、膠體金試紙條等快速檢測(cè)技術(shù)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 毒種和細(xì)胞

PRRSV HUB1毒株、Marc-145細(xì)胞、小鼠骨髓瘤SP2/0細(xì)胞由中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心保存。

1.2 主要試劑

DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自GIBCO公司；HAT、HT、PEG1450、弗氏完全和不完全佐劑購(gòu)自Sigma公司；羊抗鼠IgG（HRP標(biāo)記）購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；胎牛血清購(gòu)自BIOCHROM公司；免疫球蛋白分型檢測(cè)試劑盒（SBA Clonotyping System/AP kit）購(gòu)自Southern Biotech公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自Pierce公司；PRRSV抗體檢測(cè)試劑盒購(gòu)自LSI公司；豬瘟病毒（CSFV）、豬偽狂犬病毒（PRV）抗體檢測(cè)試劑盒購(gòu)自IDEXX公司；豬細(xì)小病毒（PPV）、豬圓環(huán)病毒（PCV）抗體檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京測(cè)迪科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)BALB/c小鼠購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCKK（京2005-2004）]。

1.4 PRRSV增殖和純化

將PRRSV接種于Marc-145細(xì)胞單層，待70%以上細(xì)胞出現(xiàn)病變時(shí)收獲病毒，反復(fù)凍融處理3次，經(jīng)4 ℃ 5000 r/min離心30 min收集上清，再經(jīng)40000 r/min超速離心150 min濃縮病毒，用適量PBS浮懸沉淀，測(cè)其蛋白含量和病毒TCID50滴度，置-70 ℃保存。

1.5 動(dòng)物免疫

用純化的PRRSV蛋白與等體積弗氏完全佐劑乳化均勻后，腹腔及背部皮下多點(diǎn)注射6～8周齡雌性BALB/c小鼠，100 μg/只；2周后用弗氏不完全佐劑進(jìn)行第二次免疫，間隔2周第三次加強(qiáng)免疫；最后一次免疫2周后采血測(cè)血清抗體效價(jià)，待效價(jià)達(dá)1:105以上時(shí)進(jìn)行細(xì)胞融合。融合前3天，用100 μg不加佐劑的抗原液進(jìn)行加強(qiáng)免疫。

1.6 雜交瘤細(xì)胞的制備和篩選

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SP2/0細(xì)胞和免疫BALB/c小鼠脾細(xì)胞按1:10比例在50%聚乙二醇（PEG1450）作用下按文獻(xiàn)[8]進(jìn)行細(xì)胞融合。融合后細(xì)胞用HAT完全培養(yǎng)液懸浮，加入鋪有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，100 μL/孔，置37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用間接ELISA和免疫過(guò)氧化物酶單層試驗(yàn)（IPMA）方法對(duì)培養(yǎng)上清進(jìn)行篩選檢測(cè)，選取OD值高、IPMA顯色較深、生長(zhǎng)良好且不與正常Marc-145細(xì)胞反應(yīng)的陽(yáng)性細(xì)胞孔，以有限稀釋法克隆3次，使克隆孔陽(yáng)性率達(dá)到100%。將篩選的強(qiáng)陽(yáng)性單克隆細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)以制備腹水，并將一部分細(xì)胞連續(xù)傳代、凍存，觀察細(xì)胞分泌單克隆抗體的穩(wěn)定性。

1.7 腹水單克隆抗體的制備及純化

選擇10～12周齡BALB/c小鼠，每只腹腔注射滅菌液體石蠟0.5 mL；2～3周后腹腔接種雜交瘤細(xì)胞（0.5～1×106個(gè)細(xì)胞/只），待小鼠腹部明顯膨大時(shí)采集腹水，3000 r/min離心10 min，腹水上清用親和層析法純化，測(cè)其蛋白含量和抗體效價(jià)，-20℃保存。

1.8 單克隆抗體特性鑒定

1.8.1 單克隆抗體類及亞類鑒定

按照免疫球蛋白分型檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行單克隆抗體類及亞類測(cè)定。

1.8.2 單克隆抗體ELISA效價(jià)測(cè)定

將單克隆抗體細(xì)胞上清或腹水10倍系列稀釋后，按間接ELISA操作流程進(jìn)行抗體效價(jià)測(cè)定。

1.8.3 單克隆抗體IPMA效價(jià)的測(cè)定

將PRRSV接種Marc-145細(xì)胞，待75%細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變時(shí)收獲細(xì)胞并進(jìn)行抗原片制備，同時(shí)制備正常Marc-145細(xì)胞作為對(duì)照，將單克隆抗體細(xì)胞上清或腹水系列倍比稀釋后，按IPMA常規(guī)方法進(jìn)行檢測(cè)、顯微鏡觀察結(jié)果。

1.8.4 單克隆抗體分泌穩(wěn)定性測(cè)定

將雜交瘤細(xì)胞連續(xù)傳代3個(gè)月及液氮凍存后復(fù)蘇，取培養(yǎng)上清檢測(cè)其抗體ELISA效價(jià)，以SP2/0細(xì)胞培養(yǎng)液作陰性對(duì)照。

1.8.5 單克隆抗體的抗原位點(diǎn)識(shí)別分析

將提純的PRRSV蛋白和Marc-145細(xì)胞對(duì)照蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜（NC）上用單克隆抗體進(jìn)行蛋白免疫印跡（Western-Blotting）分析。

1.8.6 單克隆抗體特異性鑒定

將單克隆抗體用購(gòu)買的PRRSV、CSFV、PRV、PPV、PCV抗體ELISA檢測(cè)試劑盒（二抗為HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG）進(jìn)行檢測(cè)，以SP2/0腹水作陰性對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1 PRRSV提純抗原蛋白含量和TCID50效價(jià)測(cè)定

用蛋白定量試劑盒測(cè)定純化后PRRSV蛋白含量為7.15 mg/ mL，病毒滴度為108.0TCID50/mL。

2.2 雜交瘤細(xì)胞株的建立

經(jīng)間接ELISA篩選和IPMA鑒定，3次亞克隆后獲得了2株穩(wěn)定分泌PRRSV抗體的雜交瘤細(xì)胞，命名為3C3、3D2。該細(xì)胞株具有雙親代的生物學(xué)性質(zhì)，腹腔接種BALB/c小鼠和體外連續(xù)傳代3個(gè)月均穩(wěn)定地產(chǎn)生特異性PRRSV抗體，將雜交瘤細(xì)胞凍存于液氮中，3個(gè)月、6個(gè)月、12個(gè)月后復(fù)蘇細(xì)胞生長(zhǎng)良好，抗體分泌水平未見(jiàn)降低。

2.3 單克隆抗體類與亞類的鑒定

經(jīng)免疫球蛋白分型檢測(cè)試劑盒測(cè)定，3C3和3D2兩株雜交瘤細(xì)胞免疫球蛋白亞型均為IgG2a、kappa鏈。

2.4 單克隆抗體效價(jià)測(cè)定

2.4.1 單克隆抗體間接ELISA效價(jià)測(cè)定

用間接ELISA檢測(cè)其效價(jià)（表1），結(jié)果表明兩株單克隆抗體的細(xì)胞上清效價(jià)為103～104，腹水效價(jià)為105～107。

表1 單克隆抗體ELISA效價(jià)

2.4.2 免疫過(guò)氧化物酶單層試驗(yàn)測(cè)定

將兩株單克隆抗體不同稀釋倍數(shù)用IPMA試驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)，以出現(xiàn)棕黃色至棕褐色判為陽(yáng)性反應(yīng)（表2、圖1）。結(jié)果，雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清的IPMA抗體效價(jià)在1:320以上，腹水的IPMA效價(jià)在1:2560以上。

表2 單克隆抗體IPMA效價(jià)

2.5 抗體結(jié)合位點(diǎn)分析

Western-blotting結(jié)果見(jiàn)圖2，從圖中結(jié)果可以看出兩株單克隆抗體針對(duì)的均為PRRSV 的M蛋白（約19KD）。

2.6 單克隆抗體特異性測(cè)定

間接ELISA結(jié)果顯示兩株單克隆抗體只與PRRSV反應(yīng)，與CSFV、PRV、PPV、PCV均無(wú)交叉反應(yīng)，說(shuō)明兩株單克隆抗體具有良好的特異性。

3 討論

3.1 單克隆抗體的制備

抗原的純度是影響單克隆抗體成功制備的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，本研究以純化的全病毒蛋白為抗原制備單克隆抗體，并對(duì)其進(jìn)行TCID50滴度測(cè)定。在免疫小鼠時(shí)，考慮到免疫途徑、免疫次數(shù)與間隔時(shí)間都會(huì)影響機(jī)體的免疫應(yīng)答能力，我們?cè)O(shè)計(jì)了詳細(xì)的免疫程序，前三次免疫通過(guò)頸、背部皮下免疫，最后一次加強(qiáng)免疫采用腹腔和脾臟注射，使融合前小鼠的血清ELISA效價(jià)高達(dá)1:105以上，確保了融合效果。

3.2 單克隆抗體的篩選與鑒定

單克隆抗體篩選方法需要滿足快速、簡(jiǎn)便，便于一次處理大量樣品等要求，我們用純化的PRRSV作為抗原建立了間接ELISA技術(shù)，一次可以檢測(cè)大量的細(xì)胞培養(yǎng)上清；同時(shí)，對(duì)ELISA陽(yáng)性結(jié)果再用IPMA方法和商品化PRRSV抗體檢測(cè)試劑盒進(jìn)行驗(yàn)證，準(zhǔn)確地篩選到兩株分泌抗PRRSV單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。對(duì)獲得的兩株雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行鑒定，免疫球蛋白亞型均為IgG2a、kappa鏈。經(jīng)Westernblotting證明，所得的兩株單克隆抗體均針對(duì)PRRSV的M蛋白的單克隆抗體。Magar等[9]用單克隆抗體技術(shù)鑒定表面PRRSV M蛋白上存在四個(gè)連續(xù)的表位，兩個(gè)為美洲型PRRSV特異，一個(gè)為歐洲型分離株特異，還有一個(gè)在兩個(gè)基因型中都存在。之后，Yang等[10]制備了一株具有中和活性的M蛋白單克隆抗體，隨后又鑒定出了三個(gè)不連續(xù)性表位，并分別命名為EPORF6A-C，其中EPORF6A和B都可以作為中和抗體的靶標(biāo)。在本研究中，我們獲得了兩株抗PRRSV M蛋白的單克隆抗體，為進(jìn)一步研究M蛋白的抗原表位和中和活性奠定了基礎(chǔ)。

3.3 單克隆抗體的生物學(xué)特性鑒定

美洲型和歐洲型的PRRSV分離株之間，M蛋白是最保守的蛋白，位于病毒的囊膜上，是病毒主要結(jié)構(gòu)蛋白之一，是感染豬體液免疫的主要對(duì)象。研究分析表明，M蛋白是一種免疫原性很好的蛋白質(zhì)?？烧T導(dǎo)產(chǎn)生抗體反應(yīng)，且在感染后10天即可檢出，因此，使用M蛋白作為抗原建立的診斷技術(shù)可用于檢測(cè)各型PRRSV引起的感染。

特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本研究獲得的兩株單克隆抗體只與PRRSV反應(yīng)，與CSFV、PRV、PPV、PCV均無(wú)交叉反應(yīng)；抗體效價(jià)檢測(cè)結(jié)果表明，單克隆抗體的腹水ELISA效價(jià)最高可達(dá)107，IPMA效價(jià)可達(dá)1:10240；兩株雜交瘤細(xì)胞經(jīng)凍存后復(fù)蘇，細(xì)胞生長(zhǎng)良好，腹腔接種BALB/c小鼠后可致瘤，并穩(wěn)定分泌特異性抗體，為PRRS致病機(jī)制的研究和快速診斷試劑的開(kāi)發(fā)（如膠體金診斷試紙條、免疫熒光檢測(cè)、ELISA檢測(cè)試劑盒）奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。

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