羅猛 朱大興 弓磊 邱小明 祖玲玲 孫麗亞 吳志浩 周清華

腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移是一個(gè)多基因調(diào)控、多階段、多步驟發(fā)生的復(fù)雜過(guò)程，也是導(dǎo)致腫瘤患者治療失敗和死亡的主要原因。nm23-H1基因是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的重要的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，它的結(jié)構(gòu)和功能的異常與癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)[1-5]。在前期工作中將化學(xué)合成的siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染低轉(zhuǎn)移的人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株NL9980以抑制nm23-H1基因的表達(dá)，研究發(fā)現(xiàn)NL9980細(xì)胞的侵襲力明顯增強(qiáng)[6]。但化學(xué)合成的siRNA介導(dǎo)的基因沉默只能維持較短的時(shí)間（5 d-7 d），為了更深入地研究nm23-H1基因沉默后對(duì)肺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制的影響，本研究利用慢病毒介導(dǎo)的shRNA技術(shù)，轉(zhuǎn)染人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株NL9980和肺腺癌細(xì)胞株A549，建立nm23-H1基因穩(wěn)定沉默的細(xì)胞株，并觀察其體外侵襲力的改變，為進(jìn)一步研究nm23-H1的功能、生化作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株NL9980由本實(shí)驗(yàn)室建立。pcDNA3.1（+）表達(dá)載體為本實(shí)驗(yàn)保存。A549肺腺癌細(xì)胞株購(gòu)自美國(guó)ATCC。RPMI-1640、小牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。非靶標(biāo)shRNA對(duì)照慢病毒顆粒（non-targeting shRNA, SHC002V）和特異性抑制nm23-H1基因的shRNA慢病毒顆粒（nm23-H1-shRNA；Clone ID：NM_000269.x-99s1c1、NM_000269.x-182s1c1和NM_000269.x-183s1c1）、嘌呤霉素和聚凝胺購(gòu)自美國(guó)Sigma公司?？寺…h(huán)購(gòu)自美國(guó)Corning公司。M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、dNTP mix、RNase抑制劑、隨機(jī)引物、DNA Marker購(gòu)自TAKARA公司。總RNA提取試劑Trizol Reagent購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。引物、Gold view核酸染料購(gòu)自北京賽百盛公司。SYBR GREEN Master Mix、7500實(shí)時(shí)定量PCR系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)ABI公司。nm23-H1鼠單抗（貨號(hào)：SC-56928）購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，β-actin鼠單抗（貨號(hào)：A5441）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。Boyden小室購(gòu)自美國(guó)MiliPore公司。

1.2 方法

1.2.1 shRNA構(gòu)建、慢病毒包裝 慢病毒載體為pLKO.1-puro，由U6啟動(dòng)子引導(dǎo)shRNA的合成，并具有嘌呤霉素抗性篩選標(biāo)記。將特異性靶向nm23-H1（NM_000269.2）mRNA不同序列（NM_000269.x-99s1c1：GCGTACCTTCATTGCGATCAA、NM_000269.x-182s1c1：TCCGCCTTGTTGGTCTGAAAT和NM_000269.x-183s1c1：CCGCCTTGTTGGTCTGAAATT）的21 bp反向互補(bǔ)發(fā)夾序列克隆入pLKO.1-puro載體，并包裝生產(chǎn)慢病毒，病毒滴度為106TU，購(gòu)自Sigma公司。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)、慢病毒轉(zhuǎn)染和克隆細(xì)胞株篩選 轉(zhuǎn)染前1天將2×105個(gè)NL9980和A549細(xì)胞鋪板（6孔板），第2天細(xì)胞融合度為50%-60%，每孔加入含終濃度為8μg/mL的聚凝胺和慢病毒50 μL轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染24 h后加入嘌呤霉素1 μg/mL（選擇濃度由殺菌曲線確定）。每隔2 d-3 d觀察細(xì)胞情況，更換選擇培養(yǎng)基。2周左右開(kāi)始有克隆生長(zhǎng)。克隆環(huán)方法挑取單克隆細(xì)胞入24孔板，90%-100%融合度后轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶擴(kuò)增，鑒定，保種。

1.2.3 逆轉(zhuǎn)錄和定量PCR檢測(cè)nm23-H1基因表達(dá) 根據(jù)總RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取RNA，并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄PCR。逆轉(zhuǎn)錄nm23-H1引物：Forward：5′CAAGTGCTGCGAACCACG3′；Reverse：5′GACCAACAAGGCGGAATC3′，擴(kuò)增長(zhǎng)度為420 bp。參照基因GAPDH引物序列：Forward：5′ATGGGGAAGGTGAAGGTCG3′；Reverse：5′GGGGTCATTGATGGCAACAATA3′，擴(kuò)增長(zhǎng)度為108 bp。PCR擴(kuò)增條件為：94oC、3 min，94oC、30 s，55oC、30 s，72oC、2 min，30個(gè)循環(huán)；72oC、5 min。取PCR產(chǎn)物10 μL進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。nm23-H1定量PCR引物：Forward：5′AAAGGATTCCGCCTTGTTGGT3′；Reverse：5′GCCCTGAGTGCATGTATTTCAC3′，擴(kuò)增長(zhǎng)度為124 bp。定量PCR條件為：50 °C、2 min、1個(gè)循環(huán)；95°C、10 min、1個(gè)循環(huán)；95 °C、15 s，60 °C、1 min，40個(gè)循環(huán)。做熔解曲線檢測(cè)。2-ΔΔCT法計(jì)算基因表達(dá)差異[7]。

1.2.4 Western blot印跡檢測(cè)nm23-H1表達(dá)的變化 細(xì)胞裂解后提取總蛋白，BCA方法測(cè)細(xì)胞蛋白濃度后進(jìn)行12%SDS-PAGE電泳。100 V轉(zhuǎn)膜1 h，抗nm23-H1和β-actin一抗4oC孵育過(guò)夜，洗膜后室溫二抗1 h。ECL顯影。

1.2.5 shRNA抵抗nm23-H1基因重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染拯救實(shí)驗(yàn) 根據(jù)shRNA（NM_000269.x-99s1c1:GCGTACCTTCATTGCGATCAA）序列設(shè)計(jì)nm23-H1基因shRNA抵抗序列，下劃線標(biāo)記為突變堿基，該突變?yōu)槌聊蛔儯桓淖僴m23-H1氨基酸編碼序列。突變引物：Forward：5′CGGATCCATGGCCAACTGTGA GCGAACATTTATCGCCATCAAACCA3′；Reverse: 5′GCTCTAGATCATTCATAGATCCAGTTCTGA3′。表達(dá)載體為pcDNA3.1（+）。PCR突變構(gòu)建shRNA抵抗nm23-H1基因重組質(zhì)粒。脂質(zhì)體法將shRNA抵抗nm23-H1基因重組質(zhì)粒3 μg轉(zhuǎn)染穩(wěn)定沉默nm23-H1基因表達(dá)的肺癌細(xì)胞株NL9980-99和A549-99，48 h后收獲細(xì)胞做Western blot檢測(cè)。

1.2.6 侵襲小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)侵襲力改變 每個(gè)上室加300 μL無(wú)血清的RPMI-1640進(jìn)行ECM膠水化1.5 h，下室加500 μL含10%胎牛血清的RPMI-1640；然后將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞接種于Transwell 6孔板的上室中，每孔接種細(xì)胞5×105，每組設(shè)3個(gè)平行孔。在細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育48 h，對(duì)下室細(xì)胞消化后細(xì)胞計(jì)數(shù)，以穿過(guò)膜的細(xì)胞數(shù)目來(lái)表示腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件分析系統(tǒng)處理結(jié)果，計(jì)量資料采用Mean±SD表示，應(yīng)用t檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 nm23-H1基因穩(wěn)定沉默細(xì)胞系mRNA和蛋白表達(dá)水平的檢測(cè) 人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株NL9980細(xì)胞用慢病毒介導(dǎo)的nm23-H1 shRNA轉(zhuǎn)染、篩選后，Western blot檢測(cè)3個(gè)shRNA （Clone ID: NM_000269.x-99s1c1,NM_000269.x-182s1c1和NM_000269.x-183s1c1）均獲得很好的nm23-H1基因沉默效果，以shRNA（NM_000269.x-99s1c1）最為明顯，而非靶向干擾序列則對(duì)nm23-H1的表達(dá)沒(méi)有抑制作用。故在A549肺癌細(xì)胞篩選實(shí)驗(yàn)中只選用shRNA（NM_000269.x-99s1c1）病毒顆粒作轉(zhuǎn)染，并將nm23-H1基因穩(wěn)定沉默的人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株NL9980和肺腺癌細(xì)胞株A549命名為NL9980-99和A549-99，將非靶標(biāo)（non-target）對(duì)照細(xì)胞株命名為NL9980-non和A549-non。RT-PCR結(jié)果顯示與對(duì)照細(xì)胞株相比NL9980-99細(xì)胞nm23-H1基因含量明顯降低（圖1A），A549-99細(xì)胞株實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示nm23-H1基因mRNA表達(dá)水平明顯降低（P=0.008,501）（圖1B），Western blot結(jié)果均證實(shí)nm23-H1蛋白表達(dá)明顯抑制（圖1C，圖1D）。

2.2 shRNA抵抗nm23-H1基因重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染拯救實(shí)驗(yàn) 將shRNA抵抗nm23-H1基因重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染穩(wěn)定沉默nm23-H1基因表達(dá)的肺癌細(xì)胞株NL9980-99和A549-99，48 h后收獲細(xì)胞做Western blot檢測(cè)，顯示恢復(fù)nm23-H1的正常表達(dá)（圖2A，圖2B）。

2.3 nm23-H1 基因表達(dá)抑制后侵襲力改變 Boyden小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)nm23-H1基因穩(wěn)定沉默后，NL9980-99細(xì)胞和A549-99細(xì)胞體外侵襲能力明顯增強(qiáng)，與對(duì)照組NL9980、NL9980-non和A549、A549-non細(xì)胞比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01），提示nm23-H1基因穩(wěn)定沉默促進(jìn)肺癌細(xì)胞的侵襲能力（圖3A，圖3B）。

3 討論

nm23基因是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因[1]。迄今為止，人類nm23基因已報(bào)道了8個(gè)亞型，即nm23-H1至nm23-H8，其中nm23-H1基因與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系最密切，已得到人們的普遍重視[8]。nm23-H1具有二磷酸核苷激酶（nucleotide diphosphate kinase, NDPK）活性[9]、組氨酸蛋白激酶活性[10]和3’-5’核酸外切酶活性[11]。近期研究[12]顯示nm23-H1參與了紫外線誘導(dǎo)的DNA損傷修復(fù)過(guò)程，并可能與紫外線誘發(fā)的黑色素瘤的形成有關(guān)。Conery等[13]報(bào)道nm23-H1表達(dá)的缺失可以導(dǎo)致細(xì)胞染色體不穩(wěn)定，從而參與腫瘤的形成過(guò)程。盡管20多年來(lái)國(guó)內(nèi)外做了大量的研究，nm23-H1基因抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制還未完全闡明。

我們的前期研究[14-16]顯示nm23-H1基因的低表達(dá)和雜合性缺失與人肺癌的高轉(zhuǎn)移性有密切關(guān)系。將野生型nm23-H1基因轉(zhuǎn)染人高轉(zhuǎn)移大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株L9981可以逆轉(zhuǎn)L9981的侵襲、轉(zhuǎn)移表型[17]。將化學(xué)合成的siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染低轉(zhuǎn)移的人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株NL9980抑制nm23-H1基因的表達(dá)，NL9980細(xì)胞的侵襲力明顯增強(qiáng)；通過(guò)基因芯片檢測(cè)發(fā)現(xiàn)基因表達(dá)譜發(fā)生明顯變化，表達(dá)上調(diào)的基因有707個(gè)，下調(diào)的有373個(gè)。其中上調(diào)基因主要有腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因、細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、生長(zhǎng)發(fā)育（包括胚胎發(fā)育和神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育）以及細(xì)胞運(yùn)動(dòng)遷徙相關(guān)基因；下調(diào)基因包括腫瘤抑制基因、細(xì)胞骨架相關(guān)基因等[6]。上述研究結(jié)果說(shuō)明nm23-H1基因可能是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的上游調(diào)控基因，但nm23-H1基因調(diào)控的關(guān)鍵下游分子或靶點(diǎn)尚需進(jìn)一步研究確定。

圖1 RT-PCR、定量PCR及Western blot檢測(cè)結(jié)果。A：RT-PCR檢測(cè)nm23-H1 mRNA在NL9980-99細(xì)胞中的表達(dá)，相對(duì)內(nèi)參為GAPDH，與對(duì)照相比nm23-H1含量明顯降低；1：NL9980；2：NL9980-99；B：qRT-PCR檢測(cè)nm23-H1 mRNA在A549-99細(xì)胞中的表達(dá)，相對(duì)內(nèi)參為GAPDH（P＜0.01）；C：Western blot檢測(cè)nm23-H1蛋白在 NL9980-99細(xì)胞中的表達(dá)，與對(duì)照相比表達(dá)量明顯降低；D：Western blot檢測(cè)nm23-H1蛋白在A549-99細(xì)胞中的表達(dá)，與對(duì)照相比表達(dá)量明顯降低。Fig 1 Results of RT-PCR, qRT-PCR and Western blot.A: The results of nm23-H1 mRNA RT-PCR, nm23-H1 expression greatly reduced compared with GAPDH;M: DNA marker; 1: NL9980; 2: NL9980-99; B: The results of nm23-H1 mRNA qRT-PCR, analysis of expression normalized with GAPDH (P＜0.01); C: The results of nm23-H1 expression in NL9980-99 cells by Western blot, nm23-H1 expression greatly reduced compared with β-actin; D: The results of nm23-H1 expression in A549-99 cells by Western blot,nm23-H1 expression greatly reduced compared with β-actin.

圖2 NL9980-99和A549-99細(xì)胞shRNA抵抗nm23-H1基因重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染拯救實(shí)驗(yàn)。A：NL9980-99細(xì)胞nm23-H1基因shRNA抵抗拯救實(shí)驗(yàn)，與對(duì)照組相比nm23-H1基因重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組重現(xiàn)nm23-H1的正常表達(dá)；B：A549-99細(xì)胞nm23-H1基因shRNA抵抗拯救實(shí)驗(yàn)，與對(duì)照組相比nm23-H1基因重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組重現(xiàn)nm23-H1的正常表達(dá)。Fig 2 shRNA rescue experiments in NL9980-99 and A549-99 cells. NL9980-99 and A549-99 cells were transfected with vector containing shRNA-resistant nm23-H1 cDNA to rescue the expression of nm23-H1. A: shRNA rescue experiments in NL9980-99 cells analyzed by Western blot; B: shRNA rescue experiments in A549-99 cells analyzed by Western blot.

圖3 Boyden小室檢測(cè)NL9980-99和A549-99細(xì)胞侵襲力的改變。A：NL9980-99細(xì)胞與對(duì)照相比，侵襲力明顯增強(qiáng)（P＜0.01）；B：A549-99細(xì)胞與對(duì)照相比，侵襲力明顯增強(qiáng)（P＜0.01）。Fig 3 Boyden chamber assay of NL9980-99 and A549-99 cells. A: Boyden chamber assay of NL9980-99 cells, compared with the control (P＜0.01); B:Boyden chamber assay of A549-99 cells, compared with the control (P＜0.01).

為了進(jìn)一步研究這些功能改變及相關(guān)的分子機(jī)制，需要建立穩(wěn)定沉默nm23-H1基因的肺癌細(xì)胞株。RNA干擾技術(shù)現(xiàn)已成為研究基因功能的重要工具[18]，但化學(xué)合成的siRNA介導(dǎo)的基因沉默只能維持較短的時(shí)間（5 d-7 d），而且通常轉(zhuǎn)染的效率較低[19]。因此，通過(guò)載體介導(dǎo)的RNA干擾就成為了選擇。近年來(lái)，由于慢病毒技術(shù)的發(fā)展及其自身的優(yōu)點(diǎn)，如免疫原性低、感染范圍廣，可以高效整合到宿主細(xì)胞基因組穩(wěn)定產(chǎn)生siRNA，使得慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾成為穩(wěn)定基因沉默的最常用選擇，并可克服化學(xué)合成siRNA的缺點(diǎn)[20]。

本研究通過(guò)慢病毒介導(dǎo)的特異性靶向nm23-H1基因shRNA，轉(zhuǎn)染人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株NL9980和肺腺癌細(xì)胞株A549，經(jīng)過(guò)嘌呤霉素篩選獲得了穩(wěn)定沉默nm23-H1基因表達(dá)的肺癌細(xì)胞株NL9980-99和A549-99。mRNA和蛋白水平檢測(cè)均證實(shí)nm23-H1的表達(dá)明顯降低，并通過(guò)轉(zhuǎn)染shRNA抵抗的nm23-H1表達(dá)載體，恢復(fù)nm23-H1的表達(dá)。該拯救實(shí)驗(yàn)證實(shí)我們所建立的NL9980-99和A549-99細(xì)胞中nm23-H1基因沉默是由于RNA干擾機(jī)制降解了nm23-H1基因mRNA所致，而不是脫靶效應(yīng)（offtarget effect）[19]。通過(guò)Boyden小室實(shí)驗(yàn)觀察到nm23-H1基因沉默后，人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株NL9980和人肺腺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞的侵襲力明顯增強(qiáng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。不同肺癌細(xì)胞株nm23-H1基因沉默后具有相似的侵襲力改變，逆向證明了nm23-H1基因腫瘤轉(zhuǎn)移抑制的功能。以上結(jié)果顯示本課題組成功建立了nm23-H1基因穩(wěn)定沉默的人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株NL9980-99和肺腺癌細(xì)胞株A549-99，為更深入研究nm23-H1的功能、生化作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。