周永春 陳艷 王熙才 劉馨 施湖濤 姚乾 金從國 伍治平 黃云超

宣威地區(qū)位于中國滇東北珠江流域源頭，當(dāng)?shù)嘏苑伟┑恼{(diào)整死亡率是全國平均水平的8倍，已成為嚴(yán)重危害人民群眾生命健康的疾病[1]，而導(dǎo)致肺癌患者治療失敗和死亡的主要原因是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移[2]。因此，建立可靠的原位動物模型對深入研究宣威肺癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移機(jī)制具有重要的作用。與腫瘤的異位移植相比，原位模型的建立更能模擬肺癌在人體內(nèi)的生物學(xué)特性，為研究提供相對客觀的依據(jù)[3-5]。本研究將XWLC-05宣威肺癌細(xì)胞移植到聯(lián)合免疫缺陷鼠（severe combined immunodeficiency mice, SCID）肺組織，建立肺癌原位移植模型，以探討其成瘤及轉(zhuǎn)移的生物學(xué)特性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 4周-5周齡雌雄隨機(jī)SCID小鼠72只（購自北京維通利華公司公司），許可證號為SCXK（京）2012-0001，合格證號2012-0001，體重為16 g-19.5 g，置于層流式超凈架內(nèi)的有機(jī)玻璃飼養(yǎng)盒內(nèi)（6只/盒）。飼養(yǎng)環(huán)境為無特定病原體級（specefic pathogen free, SPF），無菌標(biāo)準(zhǔn)飼料及飲水，環(huán)境溫度25oC-27oC，相對濕度為45%-50%，12 h光暗周期。動物無菌培養(yǎng)房由昆明醫(yī)科大學(xué)重點實驗室提供。接種前小鼠在動物房培養(yǎng)觀察1周以保證接種前生長狀況正常。定期給小鼠添加飼料、滅菌水及更換墊料，每兩天對小鼠進(jìn)行體重稱量，觀察其生長及精神狀況。

1.2 細(xì)胞株 宣威肺癌細(xì)胞株XWLC-05由昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供，在本實驗室常規(guī)傳代培養(yǎng)，實驗用細(xì)胞為第16代。

1.3 細(xì)胞生長曲線繪制及細(xì)胞懸液的制備 XWLC-05細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，于37oC、含5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。在滿足動物接種所需細(xì)胞量的同時，控制傳代次數(shù)，以保證細(xì)胞活力。取對數(shù)生長期的各組細(xì)胞以1.0×102個/孔接種于96孔培養(yǎng)板上，每組細(xì)胞設(shè)5個重復(fù)孔，放置于37oC、含5%CO2濃度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4 h、2 d、5 d、7 d。按細(xì)胞增殖檢測試劑盒操作說明書進(jìn)行MTS（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium, inner salt）比色法檢測，培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入20 μL MTS/PMS混合液，反應(yīng)1 h后，用酶標(biāo)儀（Bio-Rad公司）測定490 nm處吸光度值（optical delnsity, OD），實驗重復(fù)3次。根據(jù)計數(shù)結(jié)果以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，以時間為橫坐標(biāo)繪制生長曲線[6]，取第4天處于對數(shù)生長期的XWLC-05細(xì)胞（圖1），以0.25%的胰酶消化，收集細(xì)胞，離心去上清，用PBS洗滌兩次，臺盼藍(lán)染色確定細(xì)胞活力大于90%，將細(xì)胞懸浮于生理鹽水中，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106/mL（用于低劑量組接種）及1×107/mL（用于高劑量組接種）。

1.4 動物模型的建立

1.4.1 實驗動物分組 將72只小鼠隨機(jī)分為4組，每組18只。皮下移植：取其中兩組分別進(jìn)行高劑量及低劑量接種，每組中的8只用于觀察生存，10只用于監(jiān)測腫瘤及轉(zhuǎn)移情況。原位移植：取其中兩組分別進(jìn)行高劑量及低劑量接種，每組中的8只用于觀察生存，10只用于監(jiān)測腫瘤及轉(zhuǎn)移情況。

1.4.2 原位移植 用依托米酯注射液，按體重 0.01 mL/g腹腔內(nèi)注射，小鼠經(jīng)興奮煩躁期后進(jìn)入麻醉狀態(tài)，仰臥固定，前胸壁酒精消毒，在左腋前線肋弓上約1.5 cm處作一約5 mm的小切口，分離皮膚及皮下組織暴露至胸壁，分別取高劑量及低劑量組50 μL（即5×105/只和1×105/只）細(xì)胞懸液與50 μL Matrigel混勻，在快凝固之前以胰島素注射針將混合懸液注入小鼠左肺，進(jìn)針深度約3 mm，注射完后停針5 s，拔針后用眼科鏟針縫合切口，再次酒精消毒切口。

1.4.3 皮下移植 酒精消毒小鼠右腋下皮膚，針尖挑起皮膚，將針插入皮下注射50 μL細(xì)胞懸液，稍作停留后拔針，用棉簽輕輕壓住腋下針孔，以防止細(xì)胞懸液漏出。

1.5 移植瘤生長的觀察及測量

1.5.1 一般觀察及測量 定期觀察SCID小鼠的精神、飲食、排便、體重和活動等情況，當(dāng)出現(xiàn)明顯體重下降、食欲不振、飲水量減少、精神萎靡、皮膚干燥及呼吸困難等現(xiàn)象時，脫頸處死并解剖小鼠，觀察腫瘤形成及轉(zhuǎn)移情況。原位移植組：取出原位移植瘤及腫大淋巴結(jié)、肝、脾、胰、肺、腎及腦組織，用10%甲醛固定、石蠟切片、HE染色后行光鏡下病理組織學(xué)檢查。小鼠處死前用亞甲藍(lán)0.5 mL做足墊及掌墊注射，以示蹤淋巴結(jié)。皮下移植組：于腫瘤形成后第3天開始測量腫瘤大小，用游標(biāo)卡尺測量腫瘤長徑及短徑，以公式V=a2bπ/2（a為短徑，b為長徑）計算腫瘤大小，同時取出腫大淋巴結(jié)、肝、脾、胰、肺、腎及腦組織做病理組織學(xué)檢查。

1.5.2 CT掃描 小鼠處死前運用東芝64排CT對小鼠胸部進(jìn)行螺旋掃描，以層厚2 mm、層間距2 mm分別重建出橫斷位及冠狀位圖像。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，率的比較采用卡方檢驗或Fisher精確檢驗，采用Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般觀察 小鼠于麻醉后30 min左右開始蘇醒，1 h后能夠恢復(fù)活動。實驗過程中原位移植高劑量組小鼠死亡2只，因手術(shù)操作不當(dāng)導(dǎo)致氣胸死亡。原位移植高低劑量組小鼠分別于第13天和第25天出現(xiàn)消瘦、活動減少、飲食減少及倦呆乏力等惡液質(zhì)表現(xiàn)；皮下高劑量接種組在第29天出現(xiàn)以上癥狀；皮下低劑量接種組狀態(tài)良好，惡液質(zhì)出現(xiàn)較晚，最長生存期可達(dá)53天。

2.2 腫瘤形成情況

2.2.1 原位移植組 高低劑量組的成瘤率分別為81%和83%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.932），其中高劑量組于接種后第13天解剖就有腫瘤形成，且出現(xiàn)對側(cè)肺、胸膜腔及腋下淋巴結(jié)的廣泛轉(zhuǎn)移（圖2A，圖2B）；低劑量組于接種后第25天解剖有肺部原位腫瘤形成，腫瘤質(zhì)地中等，白色，浸潤周圍組織，切面呈魚肉狀，符合肺癌的病理組織特點（圖2C，圖2D）。低劑量組淋巴結(jié)、對側(cè)肺、肝、腦、骨及腎的轉(zhuǎn)移率分別為90%、80%、60%、50%、70%、60%，與原位高劑量組相比，除淋巴結(jié)（P=0.50）和對側(cè)肺（P=0.709）外，肝（P＜0.01）、腦（P＜0.01）、骨（P＜0.01）和腎（P＜0.01）兩組的轉(zhuǎn)移率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（表1）。各部位轉(zhuǎn)移病灶均經(jīng)病理組織學(xué)檢查證實（圖3）。CT掃描提示原位低劑量接種組除有肺原位成瘤外，其中3只小鼠還有胸腔積液的形成（圖4）。

2.2.2 皮下移植組 高劑量組于第7天成瘤，低劑量組于第11天成瘤（其中有1只小鼠因操作不當(dāng)未形成腫瘤），成瘤率分別為100%及94.5%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.791）（圖5），皮下移植高低劑量組與原位移植高低劑量組間的成瘤率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.365, P=0.584）。皮下腫瘤解剖后觀察：腫瘤質(zhì)地中等，白色，部分有薄包膜形成，切面呈魚肉狀，部分腫瘤過大可見中央有紅黑色壞死灶（圖2E，圖2F）。高低劑量組均未發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，與原位高低劑量移植組相比，各部位的轉(zhuǎn)移率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）（表1）。

表 1 不同細(xì)胞劑量各移植組間轉(zhuǎn)移率的比較Tab 1 Comparison of metastasis rate among different groups

2.3 小鼠生存情況 原位移植組高低劑量的中位生存期（17天、27天）明顯少于皮下移植組（33天、49天），生存分析顯示皮下移植組、原位移植組組間及組內(nèi)各劑量間的生存率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001，圖6）。

3 討論

腫瘤實驗動物模型是人類腫瘤的復(fù)制，在腫瘤發(fā)病機(jī)制研究及治療藥物篩選等領(lǐng)域發(fā)揮著重要的作用。目前國內(nèi)外腫瘤的實驗動物模型主要包括以下類型：①自發(fā)瘤模型，實驗動物未經(jīng)任何有意識的人工處置，在自然情況下所發(fā)生的腫瘤；②誘導(dǎo)模型，用致癌物在動物一定部位或一定器官誘發(fā)出的腫瘤。因存在成瘤周期長、飼養(yǎng)動物量大、成瘤率低及耗資大等缺點，以上兩類模型多應(yīng)用于職業(yè)暴露或環(huán)境污染等相關(guān)的腫瘤研究[7,8]，在常規(guī)腫瘤研究中很少運用。此外還有轉(zhuǎn)基因動物模型及目前應(yīng)用最多的移植模型，用腫瘤組織或細(xì)胞移植到動物體內(nèi)所形成的腫瘤動物模型，因其制作簡單、成瘤率穩(wěn)定及成瘤時間短而被各實驗室廣泛運用[9]。在移植瘤模型中既往常用異位皮下移植，該方法雖然成瘤率高，但因受血供及細(xì)胞因子等微環(huán)境的限制，不能反應(yīng)腫瘤在人體中的特征[10]。因此，近年來多采用原位腫瘤動物模型開展研究，它是指將人類腫瘤細(xì)胞或組織移植在動物的相應(yīng)部位，因其與在人體內(nèi)具有相同或相近的微環(huán)境，從而可獲得生物學(xué)行為更接近人體原發(fā)腫瘤特性的模型。在肺癌的研究中原位動物模型的接種方式又包括了支氣管內(nèi)注射和肺內(nèi)注射。支氣管注射操作困難、成瘤率低及瘤體的大小、數(shù)目均不穩(wěn)定，其運用受到一定的限制[11]。而與之相比，肺內(nèi)注射兼具了操作簡單、成瘤率高、成瘤時間短及腫瘤生長環(huán)境更符合人體情況等優(yōu)點。在實驗動物的選擇上既往多采用的是BALB/c裸鼠，但因其為單免疫系統(tǒng)缺陷，仍有許多人類腫瘤無法在裸鼠體內(nèi)移植成活[12]。本實驗中采用的SCID小鼠是嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷小鼠，上世紀(jì)80年代由美國Bosma等[13]改造培殖而成，由于該小鼠為T、B 細(xì)胞聯(lián)合缺陷，對移植物免疫排斥較低，因此比單一缺損T淋巴細(xì)胞的裸鼠更適于作異體移植。Gemma等[14]及Shindo-Okada等[15]曾利用PC9、PC14及A549肺腺癌細(xì)胞系進(jìn)行小鼠原位移植，除形成縱隔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移外，均未形成遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移。本研究選擇云南宣威肺癌細(xì)胞株系XWLC-05進(jìn)行小鼠移植，該細(xì)胞系細(xì)胞系2007年由昆明醫(yī)學(xué)院病理教研室建立，是目前唯一一株以宣威女性肺癌為來源建立的細(xì)胞系，材料取自宣威當(dāng)?shù)匾晃?8歲的女性肺腺癌患者，病理診斷為右肺中分化腺癌。經(jīng)實驗證明，該細(xì)胞系維持了原腫瘤的表型特征，能形成和宣威女性肺癌具有相同形態(tài)學(xué)特征的裸鼠移植瘤[16]，選擇該細(xì)胞作為體外研究的對象，能最大程度地反映宣威女性肺腺癌的生物學(xué)特征。

圖 1 XWLC-05細(xì)胞的生長狀態(tài)。A：光鏡下處于對數(shù)生長期的XWLC-05細(xì)胞（×200）；B：XWLC-05細(xì)胞生長曲線。Fig 1 Growth state of XWLC-05 cells. A:Cellular morphology of XWLC-05 cells (×200); B: Growth curve of XWLC-05 cells.

圖 2 原位及皮下移植瘤模型。A，B：原位高劑量XWLC-05細(xì)胞接種組小鼠顯示雙側(cè)肺和胸膜腔的廣泛浸潤轉(zhuǎn)移；C，D：原位低劑量XWLC-05細(xì)胞接種組小鼠顯示左肺境界清楚的腫瘤形成；E，F(xiàn)：皮下低劑量XWLC-05細(xì)胞接種組小鼠顯示皮下腫瘤的形成及腫瘤切面。Fig 2 Orthotopic transplantation and subcutaneous xenograft model. A, B: Mouse of orthotopic transplantation with high dose of XWLC-05 cells in left lung shows serious infiltration in bilateral lungs and extensive pleural metastases; C, D: Mouse of orthotopic transplantation with low dose of XWLC-05 cells in left lung shows a clear boundary tumor in left lung; E, F: Mouse of subcutaneous inoculation with low dose of XWLC-05 cells: tumor in situ and its section view.

圖 3 原位低劑量XWLC-05細(xì)胞移植組小鼠組織（HE，× 200）。A：左肺腫瘤；B：左鎖骨上淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性肺癌；C：右胸壁肺癌轉(zhuǎn)移灶。Fig 3 Representive tissue HE staining picture of mouse received orthotopic transplantation with low dose of XWLC-05 cells (HE, ×200). A: Tumor in left lung; B: Metastasis lymph node above left clavicle; C: The right chest wall metastases.

圖 4 原位低劑量XWLC-05細(xì)胞移植小鼠的胸部CT掃描影像。A：左肺下葉形的腫瘤；B：雙側(cè)肺門腫塊合并左側(cè)胸腔積液。Fig 4 Representive CT scan images of mouse received orthotopic transplantation with low dose of XWLC-05 cells. A: Tumor formed in left lung lower lobe; B: Bilateral hilar mass with left pleural effusion.

圖 5 皮下移植瘤生長曲線。A：高細(xì)胞劑量組；B：低細(xì)胞劑量組。Fig 5 Growth curve of subcutaneously transplanted tumor. A: High-dose group; B: Low-dose group.

圖 6 不同移植組各劑量間小鼠生存曲線Fig 6 Survival curve of mice in different groups

本次研究將XWLC-05細(xì)胞分兩組并以不同劑量分別接種于SCID小鼠皮下及肺原位，以觀察其成瘤及轉(zhuǎn)移情況。實驗結(jié)果顯示：皮下移植組無論高低劑量，小鼠在生存期內(nèi)都未形成遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶，考慮由于其周圍有結(jié)締組織包裹及生長的微環(huán)境缺乏多種與轉(zhuǎn)移相關(guān)的細(xì)胞因子，故僅能形成局部腫瘤，限制了腫瘤的浸潤及轉(zhuǎn)移。因此皮下移植形成的腫瘤不能滿足對肺癌轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究。與皮下移植瘤相比，原位移植具有血液供應(yīng)豐富及局部微環(huán)境更接近人體等優(yōu)越性，不僅移植成功率高，而且更利于形成轉(zhuǎn)移[17]。在本實驗的36只原位移植的小鼠中，移植成瘤率均在80%以上，使用5×105/只高劑量細(xì)胞組的小鼠于接種后短期既形成腫瘤，且發(fā)生胸腔及對側(cè)肺的廣泛轉(zhuǎn)移，在尚未形成遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移病灶前即很快死于呼吸功能衰竭，中位生存期僅有17天，不僅其發(fā)病和轉(zhuǎn)移的特點與臨床有一定的差異，且小鼠過短的生存期不利于開展轉(zhuǎn)移機(jī)制的深入研究；與之相比，使用1×105/只低劑量組細(xì)胞原位接種的小鼠生存期相對較長，亦成功形成了原位腫瘤，移植瘤發(fā)生局部浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處臟器轉(zhuǎn)移，且轉(zhuǎn)移率較高，部分有胸水形成，較好地保持了原始腫瘤的組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞形態(tài)、功能及生化特征，其轉(zhuǎn)移的發(fā)生發(fā)展符合臨床肺癌患者的特點和規(guī)律，因此筆者認(rèn)為該數(shù)量級細(xì)胞建立的腫瘤模型對轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究更為理想。在原位移植中，為避免腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散而不能形成單一的腫瘤，我們將腫瘤細(xì)胞與具有粘附性的Matrigel先混合后接種，充分保證了在局部的接種數(shù)量。

本研究以宣威肺癌XWLC-05細(xì)胞直接接種于SCID小鼠肺內(nèi)，除對原位構(gòu)建方法進(jìn)行了優(yōu)化外，還從形態(tài)學(xué)觀察、影像學(xué)檢查、病理學(xué)檢查及生存統(tǒng)計等層面對移植效果進(jìn)行了綜合評估，成功構(gòu)建了敏感、穩(wěn)定及轉(zhuǎn)移特性與人體相符的原位腫瘤動物模型，為宣威肺癌及其他非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究及抗腫瘤藥物的開發(fā)奠定了實驗基礎(chǔ)。