楊紹興 湯傳昊 王思涵 宋三泰 劉曉晴

肺癌是發(fā)病率和病死率均居第一位的腫瘤，其中非小細(xì)胞肺癌占80%，按其病理分型依次遞減為腺癌、鱗癌、大細(xì)胞肺癌等。腺癌易發(fā)生血行轉(zhuǎn)移，近年的研究[1]又發(fā)現(xiàn)其所占比例有所增長，成為女性和年輕患者中最為常見的一種類型，對(duì)肺腺癌細(xì)胞的生物學(xué)特性進(jìn)行深入的研究有著非常重要的意義。CD147，又稱基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子（EMMPRIN），是一類位于腫瘤細(xì)胞膜表面的跨膜糖蛋白，屬于免疫球蛋白超家族，能夠刺激成纖維細(xì)胞產(chǎn)生大量基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases, MMPs）[2]，可介導(dǎo)基底膜組成成分和細(xì)胞外基質(zhì)大分子的重塑，促進(jìn)腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)腫瘤血管的生成[3]。盡管CD147的功能和作用在其它類型腫瘤研究中已有報(bào)道，但在肺腺癌細(xì)胞生物學(xué)特性中還未見研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)擬通過構(gòu)建CD147的慢病毒表達(dá)載體，建立穩(wěn)定表達(dá)CD147的人肺腺癌A549細(xì)胞系，檢測上調(diào)表達(dá)CD147后MMP-9及人肺腺癌細(xì)胞增殖、侵襲能力的變化情況，為研究CD147在人肺腺癌生物學(xué)特性中的功能和作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料 過表達(dá)慢病毒載體pEGFP購自Addgene公司，慢病毒包裝質(zhì)粒pLP1、pLP2、pLP/VSVG購自Invitrogen公司。pMD-T載體購自TaKaRa公司。SYBR Green real-time PCR mixture購自Qiagen公司。限制性內(nèi)切酶、dNTP、Taq酶以及快速連接試劑盒均購自TaKaRa公司，引物合成及測序由上海英駿公司完成。CCK-8試劑盒購自DojinDo公司。轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司。慢病毒包裝細(xì)胞293FT細(xì)胞購自Invitrogen公司。人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549由清華大學(xué)生命科學(xué)院腫瘤分子研究室惠贈(zèng)。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)PubMed上CD147基因全長序列（NM 001728.3），以及pEGFP載體的酶切位點(diǎn)，進(jìn)行引物設(shè)計(jì)：CD147 sense，5' GCTAGCATCATGGCGGCTGCGCTGTT 3'，CD147 antisense，5' TCTAGAGGAAGAGTTCCTCTG GCGGACGTT 3'。 其中，分別在上游和下游的5'端加入了XbaI和NheI酶切位點(diǎn)。

1.2.2 RT-PCR擴(kuò)增人CD147全基因序列 用Trizol試劑按照說明書方法提取A549細(xì)胞總mRNA，然后取1 μg反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增CD147全長序列，擴(kuò)增條件如下：先94oC預(yù)變性5 min，94oC變性30 s，57oC退火30 s，72oC延伸90 s，共計(jì)30個(gè)循環(huán)反應(yīng)，最后72oC延伸4 min，4oC保存。反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，對(duì)所需片段進(jìn)行凝膠回收，獲得帶有XbaI和NheI雙酶切位點(diǎn)的CD147全基因組。

1.2.3 人CD147基因的慢病毒過表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定 將獲得的CD147全基因PCR克隆到pMD-T載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑取陽性克隆后在液體LB中擴(kuò)大化培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后進(jìn)行PCR及酶切鑒定，鑒定正確后送去測序。將測序驗(yàn)證后的重組質(zhì)粒和pEGFP載體分別用XbaI和NheI進(jìn)行雙酶切，回收所需要的基因及載體片段，用快速連接試劑盒進(jìn)行連接反應(yīng)，16oC過夜連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取陽性克隆后在液體LB中擴(kuò)大化培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后進(jìn)行PCR及酶切鑒定，鑒定正確后送去測序。將鑒定正確的CD147過表達(dá)載體命名為pEGFP-CD147。

1.2.4 慢病毒的包裝 慢病毒包裝細(xì)胞293FT培養(yǎng)條件為添加10%FBS的H-DMEM，取5 μg pEGFP-CD147質(zhì)粒及對(duì)照質(zhì)粒pEGFP與包裝質(zhì)粒4.2 μg pLP1、2 μg pLP2和包膜質(zhì)粒2.8 μg pLP/VSVG質(zhì)粒在無血清培養(yǎng)基中與42 μL Lipofectamine 2000混合，室溫孵育20 min，形成DNALipofectamine 2000復(fù)合物后，轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞，6 h后更換為含有1 mmol/L丙酮酸鈉的培養(yǎng)基，48 h后收集培養(yǎng)基上清，用0.45 μM濾器過濾后，超速離心濃縮病毒，分裝后-80oC保存。

1.2.5 過表達(dá)CD147的A549細(xì)胞系的建立 人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549培養(yǎng)條件為添加10%FBS的H-DMEM，當(dāng)A549細(xì)胞生長至60%密度時(shí)，吸去培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，加入pEGFPCD147和pEGFP慢病毒毒液，同時(shí)加入Polybrene，使其終濃度為8 mg/L，置37oC、5%CO2的孵箱中培養(yǎng)過夜。第2天，去除培養(yǎng)基，添加完全培養(yǎng)液，待細(xì)胞密度生長至80%-90%時(shí)，按1:3傳代。流式細(xì)胞術(shù)分選表達(dá)綠色熒光蛋白的細(xì)胞。分別命名為A549-CD147、A549-pEGFP。

1.2.6 細(xì)胞總mRNA的提取、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)及實(shí)時(shí)定量PCR檢驗(yàn)干涉效率 用Trizol試劑溶解細(xì)胞，然后按照說明書方法提取細(xì)胞總mRNA，然后取1 μg反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用SYBR GREEN mixture做染料，用iQTM5多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測CD147的過表達(dá)效率，用GAPDH做內(nèi)參，所用引物序列為：5′-CD147 sense，GCTAGCATC ATGGCGGCTGCGCTGTT-3′，5′-CD147 antisense，5′-TC TAGAGGAAGAGTTCCTCTGGCGGACGTT-3′；GAPDH sense，5′-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3′，GAPDH antisense，5′-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3′；MMP-9正義鏈：5′-TGACAGCGACAAGAAGTG-3′，MMP9反義鏈：5′-CAGTGAAGCGGTACATAGG-3′。

1.2.7 Western blot 用RIPA溶解細(xì)胞后提取細(xì)胞蛋白，各取200 μg進(jìn)行SDS-PAGE，電泳后用電轉(zhuǎn)儀進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后加入mouse anti-CD147抗體（1:300），4oC過夜，TBST洗滌3次，每次10 min，加入HRP偶聯(lián)山羊抗小鼠二抗（1:1,000），室溫孵育1 h，TBST洗滌3次，每次15 min，ECL顯影。同時(shí)以β-actin為內(nèi)參照。

1.2.8 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力 將A549細(xì)胞、A549-pEGFP、A549-CD147按照每孔 1×104/200 μL的密度接種于96孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，每組設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，分別選取24 h、48 h、72 h三個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)進(jìn)行檢測。檢測前換液1次，每孔加100 μL培養(yǎng)基和10 μL CCK-8，細(xì)胞放入37oC、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，使用酶聯(lián)儀在450 nm波長檢測光密度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取其平均值。

1.2.9 細(xì)胞侵襲能力檢測 使用Transwell（Corning Inc.,USA）檢測轉(zhuǎn)染CD147組及對(duì)照組細(xì)胞的侵襲能力變化。首先，將Matrigel置于4oC過夜使其融化，用預(yù)冷的無血清1640以1:3稀釋Matrigel，每個(gè)上室加入稀釋后的Matrigel 100 μL，室溫2 h使其凝固。然后于轉(zhuǎn)染后24 h，收集A549-CD147、A549-pEGFP和A549細(xì)胞，用無血清1640液重懸細(xì)胞，細(xì)胞記數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105個(gè)/mL。每個(gè)上室中加入100 μL細(xì)胞懸液，下室加入含10%小牛血清的1640培養(yǎng)液，每種細(xì)胞做3孔。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，取出濾膜，甲醇固定，常規(guī)HE染色。顯微鏡下計(jì)數(shù)遷移至濾膜外表面的細(xì)胞數(shù)，每張濾膜隨機(jī)計(jì)數(shù)10個(gè)視野（×200），取平均值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SASS 9.1統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，單組間的比較，采用t檢驗(yàn)。多組間采用具有一個(gè)重復(fù)測量的兩因素設(shè)計(jì)定量資料的方差分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 pEGFP-CD147慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定 利用特異性引物擴(kuò)增出了大小約為1,150 bp的目的基因條帶，與預(yù)期的大小片段一致（圖1A）。將測序驗(yàn)證正確的pMD-TCD147進(jìn)行雙酶切，回收目的片段，并連接至pEGFP表達(dá)載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pEGFP-CD147。提取質(zhì)粒后進(jìn)行XbaI和NheI雙酶切，結(jié)果顯示，酶切后呈現(xiàn)兩條條帶，與CD147目的基因片段和pEGFP載體片段的大小一致（圖1B），對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行PCR，瓊脂糖凝膠電泳后出現(xiàn)了與CD147大小一致的片段（圖1C），將酶切及PCR鑒定正確的質(zhì)粒送去測序。測序的結(jié)果與預(yù)期的CD147基因序列完全相同。將鑒定正確的CD147過表達(dá)載體命名為pEGFP-CD147。

圖 1 CD147慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定Fig 1 Construction and identification of CD147 lentiviral expression vector. A: Human CD147 whole genome obtained; 1: Human CD147 gene. B:Restriction map analysis of CD147 lentiviral expression vector; 1: pEGFP vector and CD147 gene; C: Identification of CD147 lentiviral expression vector by RT-PCR; 1: CD147 gene.

2.2 pEGFP-CD147慢病毒表達(dá)載體的包裝和轉(zhuǎn)染人肺腺癌A549細(xì)胞系 分別將pEGFP-CD147慢病毒表達(dá)載體和pEGFP空載體，與包裝質(zhì)粒pLP1、pLP2及包膜質(zhì)粒pLP/VSVG、Lipofectamine 2000共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞，48 h后熒光顯微鏡下發(fā)現(xiàn)大部分細(xì)胞呈綠色熒光表達(dá)（圖2A）。收集病毒并去除漂浮細(xì)胞和細(xì)胞碎片，濃縮后分別感染A549細(xì)胞，48 h后熒光顯微鏡下均見到部分A549細(xì)胞發(fā)綠色熒光，說明pEGFP-CD147及pEGFP成功轉(zhuǎn)入A549細(xì)胞中（圖2B）。連續(xù)將細(xì)胞培養(yǎng)1個(gè)月，分別提取感染pEGFP-CD147慢病毒表達(dá)載體的細(xì)胞和pEGFP-CD147空載體的細(xì)胞的總RNA。半定量RT-PCR分析表明，轉(zhuǎn)染pEGFP-CD147慢病毒表達(dá)載體后的細(xì)胞，CD147的mRNA表達(dá)水平明顯增高（圖2C），進(jìn)一步的實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明，對(duì)比轉(zhuǎn)染pEGFP空載體組，轉(zhuǎn)染pEGFP-CD147慢病毒表達(dá)載體后的細(xì)胞的CD147表達(dá)水平增加了2.5倍（圖2D）。說明所構(gòu)建的載體在A549細(xì)胞中表達(dá)。

2.3 A549-CD147細(xì)胞系的建立 選取轉(zhuǎn)染pEGFP-CD147慢病毒表達(dá)載體的A549細(xì)胞和轉(zhuǎn)染pEGFP空載體的A549細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分選（圖3A），分選后經(jīng)擴(kuò)增培養(yǎng)1個(gè)月，熒光顯微鏡下可見滿視野的綠色熒光標(biāo)記的細(xì)胞（圖3B）。兩組細(xì)胞的real-time PCR分析顯示，轉(zhuǎn)染pEGFPCD147組細(xì)胞的CD147的mRNA表達(dá)水平比轉(zhuǎn)染pEGFP空載體組高17.32倍（圖3C），Western blot結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，pEGFP-CD147組細(xì)胞的CD147蛋白表達(dá)水平明顯升高（圖3D），表明我們已經(jīng)成功建立了穩(wěn)定過表達(dá)CD147的人肺腺癌A549細(xì)胞系，命名為A549-CD147。

2.4 過表達(dá)CD147對(duì)MMP-9及人肺癌細(xì)胞增殖、侵襲能力的影響 Real-time PCR結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染CD147基因后，A549-CD147細(xì)胞中MMP-9 mRNA的表達(dá)明顯增加（P＜0.001）。CCK-8法檢測結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染后的第1天，3種細(xì)胞的增殖率沒有明顯差別，而第2、3天，與對(duì)照組相比，A549-CD147細(xì)胞的增殖能力明顯增強(qiáng)。A549-pEGFP細(xì)胞與A549細(xì)胞的增殖能力對(duì)比未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.001）（圖4）。Transwell結(jié)果顯示，穿透Matrigel到達(dá)濾膜的A549-CD147細(xì)胞數(shù)明顯多于A549-pEGFP和A549細(xì)胞（P＜0.001）。

3 討論

在包括對(duì)卵巢、肺、前列腺、胰腺、乳腺等惡性腫瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，MMPS的活性程度與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移潛能關(guān)系密切。而腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)的CD147使得MMPS表達(dá)數(shù)量及活性增加，從而降解基底膜的主要成分，破壞天然組織的機(jī)械屏障，促進(jìn)腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移[4]。CD147是一個(gè)在多種生理和病理過程中發(fā)揮重要作用的關(guān)鍵分子，但大家關(guān)注的重點(diǎn)還是其在腫瘤生長和發(fā)展中的功能和作用。Zheng等[5]發(fā)現(xiàn)上調(diào)CD147的表達(dá)可促進(jìn)胃癌細(xì)胞的生長和血管的生成。Wang等[6]在體外實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，CD147的表達(dá)與胃癌SGC7901細(xì)胞的增殖速度密切相關(guān)。Bougatef等[7]發(fā)現(xiàn)CD147的表達(dá)可促進(jìn)惡性黑色素細(xì)胞瘤細(xì)胞的浸潤、轉(zhuǎn)移。Hao等[8]已證實(shí)CD147的表達(dá)可能是前列腺癌細(xì)胞耐藥的一個(gè)關(guān)鍵因素。為探討CD147在肺腺癌細(xì)胞生物學(xué)特性中的功能和作用，我們首先構(gòu)建了CD147慢病毒表達(dá)載體和穩(wěn)定表達(dá)CD147的人肺腺癌A549細(xì)胞系。

圖 2 pEGFP-CD147慢病毒的包裝和感染人肺腺癌A549細(xì)胞系Fig 2 pEGFP-CD147 lentiviral packaging and infection of human lung adenocarcinoma cell line A549. A: pEGFP-CD147 lentiviral expression vector was transfected in 293FT cells; B: pEGFP-CD147 lentiviral venom infected A549 cells; C: Detection of CD147 mRNA expression levels in the respective cells by RT-PCR; D: Detection of CD147 mRNA expression levels in the respective cells by real-time PCR.

對(duì)比其它研究應(yīng)用的普通質(zhì)粒載體的方法，我們所構(gòu)建的慢病毒載體具有獲得病毒周期短，滴度高，可以感染分裂、非分裂細(xì)胞，能將外源基因高效導(dǎo)入宿主細(xì)胞，從而在細(xì)胞中穩(wěn)定長期表達(dá)siRNA、cDNA或報(bào)告基因，且不會(huì)產(chǎn)生化學(xué)轉(zhuǎn)染或腺病毒轉(zhuǎn)染引起的細(xì)胞損傷及免疫反應(yīng)。慢病毒實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)被廣泛應(yīng)用于各類基因治療的實(shí)驗(yàn)研究中[9,10]。為實(shí)現(xiàn)CD147基因在人肺腺癌A549細(xì)胞中的高效、穩(wěn)定表達(dá)，我們首先成功構(gòu)建了pEGFP-CD147重組表達(dá)質(zhì)粒，隨后進(jìn)行293FT細(xì)胞包裝慢病毒。因我們采用的慢病毒載體上表達(dá)GFP，慢病毒毒液感染A549細(xì)胞后，經(jīng)熒光顯微鏡觀察可以見到部分細(xì)胞中有GFP表達(dá)，表明A549細(xì)胞已經(jīng)有效地被慢病毒感染。感染后的細(xì)胞經(jīng)過流式細(xì)胞術(shù)分選，培養(yǎng)擴(kuò)增1個(gè)月后，細(xì)胞熒光顯示鏡下可見到滿視野的綠色熒光標(biāo)記的細(xì)胞。Real-time PCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，pEGFP-CD147組CD147的表達(dá)水平上調(diào)17.29倍，Western blot檢測結(jié)果也顯示，pEGFPCD147組的CD147的表達(dá)在蛋白水平也明顯增加。說明我們已經(jīng)成功建立了過表達(dá)CD147的人肺腺癌A549細(xì)胞系，命名為A549-CD147。我們隨后對(duì)CD147靶產(chǎn)物MMPS家族的MMP-9的表達(dá)水平進(jìn)行了real-time PCR檢測，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)CD147可上調(diào)MMP-9的表達(dá)。CCK-8和Transwell法證實(shí)A549-CD147細(xì)胞的增殖和侵襲能力明顯增強(qiáng)。根據(jù)上述研究所顯示CD147具有的功能特性，推測其有可能是一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)，這也是我們后續(xù)研究關(guān)注的重點(diǎn)。

圖 3 A549-CD147細(xì)胞系的建立Fig 3 Established the A549-CD147 cell line. A: The A549 cells transfected with p-EGFP lentiviral expression vector and p-EGFP empty vector were sorted by flow cytometry respectively; B: The A549-pEGFP cells and A549-CD147 cells after sorted by flow cytometry; C: Detection of CD147 mRNA expression levels in the respective cells by real-time PCR; D: Detection of CD147 in protein level by Western blot in cells.

圖 4 過表達(dá)CD147對(duì)MMP-9及人肺癌細(xì)胞增殖、侵襲能力的影響Fig 4 Effects on MMP-9, proliferation and invasive ability of the human lung adenocarcinoma cells after overexpression CD147. A: The relative expression rate of MMP-9 mRNA was significantly enhanced in A549-CD147 cells than that in A549 and A549-pEGFP cells; B: The growth curves indicated that the growth rates had not significant difference among A549-CD147, A549-pEGFP and A549 cells in the first day after transfection,but in the second day (P＜0.05) and the third day (P＜0.01), the growth rate was significantly higher in A549-CD147 cells than that in A549-pEGFP and A549 cells; C: Representative microscope field of filters under the Matrigel from A549-CD147, A549-pEGFP and A549 cells respectively (×100);D: The Histogram showed that the number of invasive cell was significantly more in A549-CD147 cells than that in A549-pEGFP and A549 cells(P＜0.01) .

綜上所述，我們成功構(gòu)建了CD147慢病毒表達(dá)載體，建立了穩(wěn)定上調(diào)表達(dá)CD147的A549-CD147細(xì)胞系，并對(duì)其在促進(jìn)細(xì)胞增殖和侵襲方面進(jìn)行了初步的研究。我們將利用成功構(gòu)建載體和細(xì)胞系進(jìn)一步研究CD147在人肺腺癌生物學(xué)特性中的功能和作用。