孫小亮 肖汀 楊磊 高燕寧 程貴余 孫克林

最新統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)[1]顯示，肺癌已成為美國(guó)男性和女性發(fā)病率第二位的惡性腫瘤，死亡率居各惡性腫瘤之首，成為嚴(yán)重危害人類健康的疾病之一。非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）是肺癌最常見的類型，占肺癌的85%，但5年生存率卻僅為15%。70%的肺癌患者在確診時(shí)已屬晚期，失去了手術(shù)機(jī)會(huì)[2]。如果肺癌患者能早期診斷，5年生存率可達(dá)80%[3]?；|(zhì)金屬蛋白酶-7（matrix metalloproteinase 7, MMP-7）又稱基質(zhì)溶解素，是MMPs家族成員之一，具有一定的底物特異性，主要作用于細(xì)胞外基質(zhì)、基底膜及細(xì)胞膜表面分子等，它可在人體正常上皮細(xì)胞中表達(dá)，但活性非常低。MMP-7的過表達(dá)發(fā)生于各種上皮來(lái)源的腫瘤及間質(zhì)腫瘤，其過表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)等密切相關(guān)[4]。

目前，肺癌組織中MMP-7蛋白表達(dá)情況的檢測(cè)國(guó)內(nèi)外有較多的報(bào)道，血清中MMP-7的RNA檢測(cè)近來(lái)也有少量報(bào)道，但尚未見關(guān)于外周血血漿中MMP-7的蛋白水平的研究，本研究旨在通過雙抗體ELISA夾心法檢測(cè)肺癌患者和正常人外周血血漿中MMP-7的蛋白水平，以探討其是否可以作為肺癌的腫瘤標(biāo)志物及其與肺癌的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 實(shí)驗(yàn)組為2010年3月-2011年5月在中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院確診的肺癌患者114例。入組標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)支氣管鏡活檢、細(xì)胞學(xué)或術(shù)后病理證實(shí)為肺癌患者；②未接受過放化療治療；③無(wú)嚴(yán)重肺間質(zhì)性疾病。根據(jù)世界衛(wèi)生組織（World Health Organization, WHO）2004年的肺癌組織學(xué)分型標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行肺癌組織學(xué)分型，根據(jù)國(guó)際抗癌聯(lián)盟（International Union Against Cancer, UICC）2009年發(fā)布的第7版肺癌TNM分期系統(tǒng)進(jìn)行肺癌分期。114例肺癌患者包括男性77例，女性37例；中位年齡60歲（38歲-78歲）；既往有吸煙史65例，無(wú)吸煙史49例；腫瘤直徑≤3 cm 53例，＞3 cm 61例；鱗癌42例，腺癌52例，小細(xì)胞肺癌10例，其它（類癌、支氣管內(nèi)粘液表皮樣癌、非典型類癌）3例，無(wú)明確病理類型7例；低分化38例，中分化47例，高分化8例，無(wú)明確分化21例；無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移40例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移59例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移不詳15例；I期+II期61例，III期+IV期53例。詳細(xì)臨床資料見表1。

對(duì)照組為中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院防癌科體檢的100例性別和年齡匹配的正常人群，既往均無(wú)嚴(yán)重肺間質(zhì)疾病。

1.2 ELISA方法 用EDTA抗凝管采肺癌患者空腹靜脈血，置4oC冰箱暫存，2 h內(nèi)送實(shí)驗(yàn)室，經(jīng)低溫離心（1,500 rpm, 4oC, 10 min）分離，取上層血漿分裝后保存-80oC冰箱待檢。對(duì)照組正常人的外周血樣品由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院防癌科提供。應(yīng)用ELISA雙抗體夾心法檢測(cè)外周血血漿中MMP-7蛋白水平（按照MMP-7 ELISA KIT[美國(guó)R&D公司，貨號(hào)為SMP700]說(shuō)明書進(jìn)行）。操作步驟如下：從室溫平衡20 min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4oC冰箱；標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度：標(biāo)準(zhǔn)品（S0-S8）濃度依次為0 ng/mL、0.156 ng/mL、0.312 ng/mL、0.625 ng/mL、1.25 ng/mL、2.5 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL。樣本孔先加樣本稀釋液25 μL，再加待測(cè)樣本25 μL，標(biāo)準(zhǔn)品孔加50 μL標(biāo)準(zhǔn)品，空白孔加PBS液，置于水平振蕩器（500±50）rpm室溫孵育2 h。洗板去除多余樣品，1×PBST緩沖液洗板4次。加酶標(biāo)抗體：每個(gè)反應(yīng)孔加200 μL，置于水平振蕩器室溫孵育2 h。洗板去除多余抗體，1×PBST緩沖液洗板4次。顯色：每個(gè)反應(yīng)孔中分別加入200 μL新鮮配置的顯色液（A+B），室溫避光反應(yīng)30 min。終止反應(yīng)：每個(gè)反應(yīng)孔加入終止液50 μL，終止反應(yīng)。在酶標(biāo)儀上于450 nm處測(cè)定各孔的OD值。標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：分別以濃度為0、0.156 ng/mL、0.312 ng/mL、0.625 ng/mL、1.25 ng/mL、2.5 ng/mL、5 ng/mL和10 ng/mL的MMP-7標(biāo)準(zhǔn)蛋白為S0-S8標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)，檢測(cè)其OD值，以S0點(diǎn)為空白對(duì)照，以S0-S8標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的OD值為縱坐標(biāo)，制作出標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得標(biāo)準(zhǔn)曲線公式及相關(guān)系數(shù)，根據(jù)公式計(jì)算相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度值（ng/mL）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)（Mann-Whitney U test），符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺癌患者與正常人外周血血漿中MMP-7的蛋白水平 肺癌患者外周血血漿中MMP-7蛋白濃度（n=114, median=0.72 ng/mL）明顯高于正常人外周血血漿中MMP-7蛋白濃度（n=100, median=0.30 ng/mL），兩組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-6.649，P＜0.001，圖1）。

2.2 肺癌患者外周血血漿中MMP-7的蛋白濃度與肺癌患者臨床特征的關(guān)系 將肺癌患者按照臨床特征分組，分別比較各組間MMP-7蛋白濃度的差異，結(jié)果（表1）提示：年齡（≤60歲和＞60歲）、性別（男和女）、吸煙史（有和無(wú)）、腫瘤大?。ā? cm和＞3 cm）、病理類型（鱗癌、腺癌、小細(xì)胞肺癌等）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（有和無(wú)）及分期（I期+II期和III期+IV期）各組的肺癌患者外周血血漿中MMP-7蛋白濃度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3 以血漿中MMP-7濃度作為診斷標(biāo)準(zhǔn)的診斷效能 采用血漿中MMP-7濃度區(qū)分肺癌病例和正常人群時(shí)，接受者操作特性曲線（receiver operating characteristic curve, ROC）的曲線下面積（area under the ROC curve, AUC）為0.764，當(dāng)cutoff值定為0.56 ng/mL，MMP-7檢測(cè)肺癌的敏感性為62.3%，特異性為76.0%（圖2）。

3 討論

進(jìn)入21世紀(jì)以后，肺癌已經(jīng)超過胃癌和肝癌成為我國(guó)惡性腫瘤死因的第一位[5]。2005年我國(guó)肺癌新發(fā)病例數(shù)為536,407人，死亡病例數(shù)475,768人，年平均增長(zhǎng)1.63%[6]，早期肺癌經(jīng)積極治療，5年生存率可達(dá)60%以上，但肺癌的總體5年生存率卻低于15%，主要原因是肺癌發(fā)病隱匿，多數(shù)在診斷時(shí)已屬晚期。因此，研究肺癌的生物學(xué)特性對(duì)肺癌的診治顯得尤為重要。

基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）是一類具有Zn2+依賴性的內(nèi)源性蛋白水解酶，幾乎能降解除多糖外細(xì)胞外基質(zhì)的所有成分。自1962年Gross等人首先發(fā)現(xiàn)第一種間質(zhì)膠原酶并命名為MMP-1后，至今在MMP家族中至少已發(fā)現(xiàn)25個(gè)成員[7]。MMP-7是一種分泌型蛋白，由Sellers和Woessner于1980年在大鼠子宮中發(fā)現(xiàn)，1988年第一次成功克隆出人的同源基因[8]。人類MMP-7基因定位于11q21-q22，與MMPs家族其它MMP相比較，MMP-7分子量只有28 kDa，是目前所發(fā)現(xiàn)的相對(duì)分子質(zhì)量最小的MMPs。MMP-7在消化道腫瘤的進(jìn)展期存在過表達(dá)現(xiàn)象，如食管[9]、胃[10]、結(jié)腸[11]、肝[12]和胰腺[13]。Liu等[14]研究了MMP-7在人類肺腺癌A549細(xì)胞系中的表達(dá)及作用，提示MMP-7與肺癌細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)。

本研究通過ELISA法檢測(cè)114例肺癌患者和100例正常人外周血血漿中MMP-7蛋白水平，證實(shí)肺癌患者外周血血漿中MMP-7蛋白水平明顯高于正常人外周血血漿中MMP-7蛋白水平（P＜0.001），當(dāng)cutoff值為0.56 ng/mL時(shí)，MMP-7檢測(cè)肺癌的敏感性為62.3%，特異性為76.0%，說(shuō)明MMP-7可能成為一種輔助肺癌診斷的腫瘤標(biāo)志物，并有希望成為一種新的肺癌治療的靶向藥物的靶標(biāo)。但因MMP-7表達(dá)于各種上皮來(lái)源的腫瘤及間質(zhì)腫瘤，無(wú)特異性，故目前尚無(wú)證據(jù)表明其可以早期診斷肺癌。況且，肺癌的早期診斷是一項(xiàng)重大的挑戰(zhàn)，尤其是單一標(biāo)志物更難以做到。

目前，已有多項(xiàng)研究[15-17]報(bào)告證實(shí)肺癌組織中MMP-7的表達(dá)明顯高于正常肺組織，且肺癌組織中MMP-7的表達(dá)與腫瘤的分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分期及預(yù)后等密切相關(guān)，但也有研究[18]表明肺癌組織中MMP-7的表達(dá)與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及分期等無(wú)關(guān)。但尚未見有肺癌患者外周血中MMP-7蛋白水平與腫瘤分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及分期等生物學(xué)特性的相關(guān)文章報(bào)道。本研究通過ELISA法檢測(cè)肺癌患者外周血中MMP-7蛋白濃度，然后根據(jù)肺癌的生物學(xué)特性進(jìn)行分組分析，結(jié)果表明肺癌患者外周血中MMP-7蛋白濃度與肺癌患者的年齡、性別、有無(wú)吸煙史、腫瘤大小、病理類型、淋巴結(jié)有無(wú)轉(zhuǎn)移及分期均無(wú)明顯相關(guān)性，分析原因可能為：①樣本量的限制；②目前尚無(wú)證據(jù)證明肺癌組織中MMP-7表達(dá)與外周血中MMP-7蛋白水平有一致性；③外周血中的腫瘤標(biāo)志物僅具有輔助診斷的作用，與腫瘤的生物學(xué)特性本來(lái)就沒有直接的關(guān)系（目前已被臨床廣泛接受并應(yīng)用的外周血PSA、AFP等標(biāo)志物可以輔助甚至早期診斷前列腺癌、肝細(xì)胞肝癌等，但臨床已證實(shí)其濃度與腫瘤的生物學(xué)特性無(wú)相關(guān)性）。因此，尚需要更進(jìn)一步大樣本的臨床研究證實(shí)。

圖 1 肺癌患者和正常人外周血中MMP-7蛋白濃度Fig 1 MMP-7 concentrations in lung cancer patients and normal controls

圖 2 采用血漿中MMP-7濃度區(qū)分肺癌患者和正常人的ROC曲線Fig 2 The ROC curve of MMP-7. ROC: receiver operating characteristic curve.

表 1 肺癌患者外周血中MMP-7蛋白濃度Tab 1 The results of MMP-7 concentration in lung cancer patients