顏梅新,黃偉華,鄧展云,黃誠華,韋金菊
(廣西壯族自治區(qū)甘蔗研究所/廣西甘蔗遺傳改良重點實驗室,南寧 530007)
甘蔗花葉病毒(Sugarcane mosaic virus,SCMV)引起的甘蔗花葉病是重要的甘蔗病害之一,在我國浙江[1]、福建[2]、廣東[3]、廣西[4]、云南[5]等地甘蔗產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生,為害嚴重。國內(nèi)外對SCMV特性、分類地位、多樣性等方面進行了研究,迄今,報道了200多個SCMV分離物CP基因序列,有的還進行全基因組序列測定[6-8],許東林等2005年對華南地區(qū)引種基地侵染甘蔗的SCMV遺傳多樣性進行報道[3]。廣西是SCMV的主要發(fā)生地區(qū)之一,但至今尚未對全區(qū)甘蔗品種品系間感SCMV進行調(diào)查,為此我們進行了相關研究。本文簡要報道廣西蔗區(qū)侵染甘蔗SCMV的初步調(diào)查結果。
從廣西各主要蔗區(qū)采集不同品種(品系)顯癥的甘蔗樣品,以莖尖組培脫毒的健康植株葉片作為陰性對照。采用天根生化科技(北京)有限公司的RNAprep pure植物總RNA提取試劑盒抽提葉組織總RNA,具體步驟參考試劑盒說明書。
RT-PCR 擴增引物根據(jù)文獻[9]合成,上游引物 SCMVF4 (5′-GTTTTYCACCAAGCTGGAACAGTC-3′;Y=C or T),下游引物 SCMVR3 (5′-AGCTGTGTGTCTCTCTGTATTCTC-3′),預期擴增產(chǎn)物約 700 bp。RT-PCR 用購自寶(大連)生物工程有限公司的PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver.2試劑盒進行,反應體系參照試劑盒說明,RT 體系:50μL 反應體系中總 RNA 約 0.08μg/μL、PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 2 μL、2×1 Step Buffer 25 μL、引物 SCMVF4 和 SCMVR3(20 μM)各 1 μL ,用 DEPC ddH2O 補足 50 μL。 反應程序為:45℃30min;95℃ 2 min;94℃ 1min,60℃ 1min,72℃ 1min,35 個循環(huán);72℃ 5min。 PCR 反應結束后, 擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳,在UVP凝膠成像系統(tǒng)中觀察檢測結果。對部分RT-PCR產(chǎn)物直接送測序和BLAST比對,驗證檢測結果的正確性。
2010年5—10月間先后從廣西甘蔗研究所、馱盧、憑祥、柳州、柳城、鹿寨、百色、貴港等甘蔗主產(chǎn)區(qū)采集不同品種(品系)顯癥甘蔗樣品進行SCMV RT-PCR分子檢測。
以各地顯癥病葉組織總RNA抽提液為模板,經(jīng)引物對SCMVF4/SCMVR3進行一步法RT-PCR擴增。結果所檢測36份樣品中,其中25份顯陽性(占69.4%),獲得預期大?。s700 bp)的DNA電泳條帶,健康和陰性對照樣品均無任何擴增電泳(圖1),另外11份未檢出SCMV的顯癥樣品均可檢出SrMV(另文報道)。其中對8份擴增產(chǎn)物進行直接測序,結果有4份樣品獲得核苷酸數(shù)據(jù),另外有4份測序不成功(產(chǎn)物濃度低,測序信號出現(xiàn)雙峰或多峰)。所得序列在GenBank中比對,結果與巴西和中國云南等地的多個SCMV分離物有96%~100%同源性,確認它們均屬SCMV基因片斷序列。
圖1 一步法RT-PCR檢測甘蔗植株葉片樣品中的SCMV
在所調(diào)查的品種(品系)中,目前廣西主栽品種ROC22除在柳城蔗區(qū)未檢測到SCMV(檢測到SrMV,另文發(fā)表)外,其它蔗區(qū)均檢測到,ROC22最易受SCMV侵染;其它臺糖系列如臺糖16、臺糖28、臺糖95-889、臺優(yōu)均檢測到SCMV;柳城系列品種柳城03-182,柳城03-1137檢測結果也呈陽性;廣西甘蔗研究所許多品系也都受到SCMV的感染(見表1)。
表1 廣西蔗區(qū)SCMV調(diào)查結果
本研究所調(diào)查的品種 (品系)中,目前主栽品種ROC22除在柳城蔗區(qū)未檢測到SCMV(檢測到SrMV,另文發(fā)表)外,在其他蔗區(qū)均檢測到SCMV,說明ROC22最易受SCMV侵染。廣西蔗區(qū)比較嚴重的問題是品種單一化,連年種植。據(jù)我們2010年調(diào)查,柳州地區(qū)甘蔗品種ROC22感花葉病比較嚴重,每一塊蔗田平均30%顯花葉癥,有的甚至達100%。應該引起有關部門的重視,有效的防治方法是使用健康種苗或者替換品種,更換其它抗病品種。其它臺糖系列如臺糖16、臺糖28、臺糖95-889、臺優(yōu)均檢測到SCMV;柳城系列品種柳城03-182、柳城03-1137也易感染SCMV;廣西甘蔗研究所許多品系也檢測到SCMV。了解這些情況,對于育種工作者來說尤為重要,為篩選親本培育抗病品種提供參考。
許東林等對華南地區(qū)引種基地侵染甘蔗的SCMV遺傳多樣性進行研究,構建系統(tǒng)進化樹發(fā)現(xiàn),除廣東分離物SCMV-W31和海南分離物SCMV-N8外,其它分離物高度相近,聚集成一個獨立的簇[3]。我們廣西的SCMV遺傳多樣性如何,是否與上述結果相類似,需要做進一步研究分析。
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