王柏琦 程愛蘭

穿心蓮內(nèi)酯對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞增殖以及Na+-K+-ATP酶活性的影響

王柏琦 程愛蘭

目的 觀察穿心蓮內(nèi)酯(Andrographolide, AD)對(duì)人鼻咽癌CNE-2細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，并研究其對(duì)凋亡的作用機(jī)制。方法 體外培養(yǎng)CNE-2細(xì)胞，分別用1.0mmol/L、3.0mmol/L、5.5μmol/L的AD處理細(xì)胞24h、48h、72h。CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞的增殖抑制率；流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期的變化；無機(jī)磷法檢測(cè)Na+-K+-ATP酶活性改變。結(jié)果 AD能顯著抑制CNE-2細(xì)胞的增殖，使其細(xì)胞周期停滯于S期和G2/M期；不同濃度的AD能降低Na+-K+-ATP酶活性且呈劑量依賴性，即當(dāng)AD濃度為1.0μmol/L時(shí)，能使酶活性降低至83%，3.0μmol/L時(shí)其活性降為63.3%，而5.5μmol/L AD能使Na+-K+-ATP酶活性降低至42%。結(jié)論 AD對(duì)鼻咽癌細(xì)胞增殖具有一定的抑制作用，有望成為一種潛在的腫瘤治療藥物。

穿心蓮內(nèi)酯；鼻咽癌細(xì)胞；增殖抑制；腫瘤治療藥物

人類鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma，NPC)是我國(guó)較為常見的頭頸部惡性腫瘤之一。其發(fā)生跟其他腫瘤類似，也是一個(gè)多因素、多步驟、多階段的復(fù)雜過程，涉及到宿主體內(nèi)的基因型以及表型的變化[1-2]。NPC早期多無明顯臨床癥狀，往往就診時(shí)已到中晚期，且大多患者因發(fā)生轉(zhuǎn)移而失去手術(shù)的最佳時(shí)機(jī)。因此，了解NPC的作用機(jī)制并尋求有效的抗癌藥物是當(dāng)務(wù)之急。

目前，學(xué)者們把抗癌藥物治療策略轉(zhuǎn)向抑制腫瘤侵襲生長(zhǎng)過程中的特異性分子和通路的分子靶向治療。在癌癥的發(fā)生中，Na+-K+-ATP酶誘導(dǎo)細(xì)胞黏附及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用不可忽視，目前認(rèn)為，其表達(dá)及活性與癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，已成為當(dāng)前抗癌藥物的一個(gè)重要靶標(biāo)。

眾所周知，穿心蓮內(nèi)酯(And rographolide, AD) 是從我國(guó)傳統(tǒng)中草藥穿心蓮中提取出來的一類二萜類化合物，常用于消炎解毒等方面的治療，臨床上常用于治療各種感染性疾病[3]。最近研究表明，AD不僅有抗炎作用，而且具有抗腫瘤的潛能[4]。但是有關(guān)AD在NPC中的作用尚不清楚。本研究意在探討AD對(duì)鼻咽癌細(xì)胞增殖有無影響，并從Na+-K+-ATP酶活性方面探討其在NPC中的治療價(jià)值。

1 資料和方法

1.1 細(xì)胞和主要試劑 鼻咽癌CNE-2細(xì)胞由中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院腫瘤所惠贈(zèng)；穿心蓮內(nèi)酯（A nd ro）購(gòu)自Sigm a-A ld rich公司，并用二甲基亞砜溶解使其成為濃度為15mmol/L的貯存液。胎牛血清、RPM I-1640培養(yǎng)基、抗生素均購(gòu)于美國(guó)Invitrogen。其他試劑均購(gòu)于上海生工。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與處理 人鼻咽癌細(xì)胞系CNE-2用含10%胎牛血清的RPM I-1640培養(yǎng)基（pH 7.2）在37℃、5% CO2、飽和濕度條件下進(jìn)行傳代培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)細(xì)胞密度調(diào)整為108/L，分為陰性對(duì)照組和AD處理組。其中對(duì)照組加入等量的RPM I-1640培養(yǎng)基，處理組加入1.0mm ol/L、3.0mm ol/L、5.5μm ol/L的AD，在37℃下分別處理細(xì)胞24h、48h、72h。

1.3 CCK-8檢測(cè)鼻咽癌細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 取長(zhǎng)勢(shì)良好的CNE-2細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104/m L后接種于96孔板中（每孔100uL），每組設(shè)立5個(gè)復(fù)孔，孵育24h。待細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度的AD孵育24～72h。細(xì)胞處理結(jié)束后，加入10μL CCK-8溶液（注意避免產(chǎn)生氣泡），37℃繼續(xù)培養(yǎng)1～4h。用酶標(biāo)儀測(cè)定其在450nm處的吸光度。細(xì)胞抑制率為：空白組OD值-處理組OD值/空白組OD值×100%。

1.4 FCM法檢測(cè)CNE-2細(xì)胞周期 采用AD處理過的CNE-2細(xì)胞（約1×106個(gè)），實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均加入75%的乙醇1.5m L，4℃固定過夜。上機(jī)前處理：將固定后的CNE-2細(xì)胞用低溫離心機(jī)離心，條件為1000rpm 5m in，丟棄上清，再用PBS洗滌2～3次。最后用200μL的預(yù)冷的PBS重懸浮CNE-2細(xì)胞，最后加入PI染液0.5m L并避光染色30m in。染色完后用200目尼龍網(wǎng)過濾，用FCM檢測(cè)細(xì)胞核中PI熒光強(qiáng)度，檢測(cè)條件：波長(zhǎng)為488nm，變異系數(shù)<2%，并通過專業(yè)軟件確定不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞比例。

1.5 Na+-K+-ATP酶活性分析 通過測(cè)定酶促反應(yīng)釋放的無機(jī)磷（Pi）的含量多少來確定ATP酶的活性改變情況。其反應(yīng)體系包括20mm ol/L KC l、100mmol/L NaC l、30mm ol/L T ris-HC l緩沖液（pH 7.4）、2mmol/L ATP以及新鮮細(xì)胞線粒體分離物。反應(yīng)體系加入ATP后，30℃孵育15m in，接著加入15%三氯乙酸終止反應(yīng)。通過測(cè)量640nm處的吸光度分析釋放的無機(jī)磷的含量。ATP酶活性的定義為1m g蛋白質(zhì)1h內(nèi)催化ATP生成1μmol/L 無機(jī)磷的量為1個(gè)單位ATP酶活性。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理，以上實(shí)驗(yàn)所得到的計(jì)量資料數(shù)據(jù)均用（）表示，重復(fù)3次，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AD對(duì)CNE-2細(xì)胞增殖影響 本研究采用CCK-8法檢測(cè)AD對(duì)CNE-2細(xì)胞的體外生長(zhǎng)呈時(shí)間-劑量依賴性。從表1可以看出，濃度分別為0、1mm ol/L.0、3.0mm ol/L、5.5μm ol/L的AD體外能顯著抑制CNE-2細(xì)胞。不同濃度AD在同一的時(shí)間點(diǎn)對(duì)CNE-2抑制率劑量增加而遞增。而同一藥物濃度隨作用時(shí)間的延長(zhǎng)其抑制率也明顯增強(qiáng)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異顯著（P<0.05）。

2.2 AD對(duì)CNE-2細(xì)胞周期的影響 0、1.0mm o l/L、3.0mmol/L、5.5μmol/L的AD作用CNE-2細(xì)胞72h后，AD處理組相對(duì)于對(duì)照組，不同濃度的AD能使CNE-2細(xì)胞的G0/G1期細(xì)胞比例隨AD濃度增加而減少（P<0.05），而S期細(xì)胞和G2/M期比例增高反而升高（P<0.05），詳見表2。

2.3 不同濃度AD對(duì)Na+-K+-ATP酶活性的影響 不同濃度的AD能不同程度抑制CNE-2細(xì)胞Na+-K+-ATP酶活性。其中AD濃度為1.0μmol/L時(shí)，能使酶活性降低至83%，3.0μmol/L時(shí)其活性為63.3%，而5.5μmol/L AD能使Na+-K+-ATP酶活性降低至42%，見圖3所示。

表1 不同濃度AD在不同作用時(shí)間下對(duì)CNE-2細(xì)胞增值的抑制率

表2 不同濃度AD作用CNE-2細(xì)胞72h后對(duì)其細(xì)胞周期影響分布

圖3 不同濃度AD對(duì)CNE-2細(xì)胞Na+-K+-ATP酶活性的影響aP<0.05 VS 對(duì)照組

3 討論

鼻咽癌患者發(fā)病早期通常選擇放射治療，但總體效果欠佳，原因是不僅鼻咽癌的復(fù)發(fā)率較高，且患者就診時(shí)大多已經(jīng)到了中晚期。為了選擇更為有效的治療方法，人們堅(jiān)持不懈地嘗試各種方法，包括基因治療、免疫治療以及化療等[5-7]。但現(xiàn)有的治療手段以及抗癌藥物仍然得不到比較滿意的結(jié)果，因此尋求新的藥物是當(dāng)務(wù)之急。

本研究中，我們的研究證實(shí)AD能顯著抑制鼻咽癌CNE-2細(xì)胞的生長(zhǎng)，呈劑量和時(shí)間依賴性及使其阻滯于細(xì)胞生長(zhǎng)周期的S期和G2/M期，并能有效地降低Na+-K+-ATP酶活性。這些研究結(jié)果表明AD可能是一種有效延緩鼻咽癌進(jìn)展的潛在性藥物，其作用機(jī)制可能是降低Na+-K+-ATP酶活性，減少細(xì)胞間黏附及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)現(xiàn)的。Na+-K+-ATP酶為三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵酶，由兩個(gè)亞單位組成，即1個(gè)α-亞單位和1個(gè)β亞單位組成的異源二聚體。其中α-亞單位是一種跨膜蛋白，可促進(jìn)細(xì)胞外K+和細(xì)胞內(nèi)Na+之間交換[8-9]，所以該酶可調(diào)節(jié)體內(nèi)外離子間的動(dòng)態(tài)平衡。一般認(rèn)為引起Na+-K+-ATP酶活性發(fā)生改變各種因素，均可引起線粒體跨膜勢(shì)能的改變，因而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡及釋放凋亡相關(guān)分子[10-11]。在本研究中，AD的確能引起Na+-K+-ATP酶活性降低，表明AD引起鼻咽癌細(xì)胞中Na+-K+-ATP酶的α-亞單位功能發(fā)生了改變或破壞了線粒體膜的功能，表明線粒體功能障礙可能是AD誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞凋亡的最終結(jié)局[12]。

綜上所述，AD能顯著抑制CNE-2細(xì)胞的增殖并能降低Na+-K+-ATP酶活性，從而引起CNE-2細(xì)胞凋亡。這表明AD可能是一種潛在的抗癌藥物。但作為一種新的抗癌治療藥物，對(duì)鼻咽癌細(xì)胞種類以及癌癥的分期的不同可能療效不同，并且其在體內(nèi)研究的有效性及安全性尚需進(jìn)一步研究。

[1] 蘭桂萍,林輝,廖建,等.2007～2008年廣西蒼梧縣石橋鎮(zhèn)鼻咽癌普查結(jié)果初步分析[J].中國(guó)腫瘤臨床,2010,37⑽:576-578.

[2] 羅偉仁,陳小毅,蔡瓊珍,等.COX-2和E-鈣黏素在鼻咽癌組織中的表達(dá)及其相互關(guān)系[J].臨床耳鼻咽喉科雜志,2006,20(17):800-802.

[3] Lee KC, Chang HH, Chung YH, et al. Andrographolide acts as an anti-inflammatory agent in LPS-stimulated RAW264.7macrophages by inhibiting STAT3-mediated suppression of the NF-kappaB pathway[J]. J Ethnopharmacol, 2011,135⑶:678-684

[4] Pratheeshkumar P, Kuttan G. Andrographolide inhibits human umbilical vein endothelial cell invasion andmigration by regulating MMP-2 and MMP-9 during angiogenesis[J].J Environ Pathol Toxicol Oncol, 2011,30⑴:33-41

[5] Arango BA, Castrellon AB, Perez CA, et al. Nasopharyngeal carcinoma: alternative treatment options after disease progression[J]. Expert Rev Anticancer Ther, 2010,10⑶:377-386.

[6] De Paoli P. Novel virally targeted therapies of EBV-associated tumors[J]. Curr Cancer Drug Targets, 2008,8⑺:591-596.

[7] 邱壽慶,唐錕.局部晚期鼻咽癌同期放化療的療效觀察[J].當(dāng)代醫(yī)學(xué),2012,18(12):52.

[8] Chung C, Mader CC, Schmitz JC, et al. The vacuolar-ATPase modulates matrix metalloproteinase isoforms in humanpancreatic cancer[J]. Lab Invest, 2011,91⑸:732-743

[9] Garcia-Garcia A, Perez-Sayans GM, Rodriguez MJ, et al. Immunohistochemical localization of C1 subunit of V-ATPase (ATPase C1) in oralsquamous cell cancer and normal oral mucosa[J]. Biotech Histochem, 2012,87⑵:133-139

[10] Rajasekaran SA, Huynh TP, Wolle DG, et al. Na,K-ATPase subunits as markers for epithelial-mesenchymal transition in cancerand fibrosis[J]. Mol Cancer Ther, 2010,9⑹:1515-1524

[11] Sanchez-Cenizo L, Formentini L, Aldea M, et al. Up-regulation of the ATPase inhibitory factor 1 (IF1) of the mitochondrial H+-ATPsynthase in human tumors mediates the metabolic shift of cancer cells to aWarburg phenotype[J]. J Biol Chem, 2010,285(33):25308-25313

[12] Huang KH, Chow KC, Chang HW, et al. ATPase family AAA domain containing 3A is an anti-apoptotic factor and asecretion regulator of PSA in prostate cancer[J]. Int J Mol Med, 2011,28⑴:9-15

book=27,ebook=90

10.3969/j.issn.1009-4393.2012.26.017

421001 南華大學(xué)腫瘤研究所 （王柏琦 程愛蘭） 421001南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院腫瘤內(nèi)科（王柏琦）