秘祖霞，盧偉英，徐 雯

(海南醫(yī)學院附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學科，海南 海口 570102)

兩種胚胎凍融方法對累積妊娠率的影響

秘祖霞，盧偉英，徐 雯*

(海南醫(yī)學院附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學科，海南 海口 570102)

目的比較玻璃化法和程序法對人第3天卵裂期胚胎凍融移植周期累積妊娠率的影響。方法選取程序化凍融周期92例、玻璃化法凍融周期179例，比較分析這兩種凍融方法在存活率、累積臨床妊娠率等方面的效果。結果玻璃化法在胚胎復蘇存活率(94.3%vs 53.9%，P＜0.01)、復蘇完整胚胎形態(tài)(89.4%vs 36.3%，P＜0.01)、累積臨床妊娠率(28.2%vs 43%，0.01＜P＜0.05)等方面均明顯優(yōu)于程序化法，但在在胚胎植入率(13.7%vs 13.5%)、流產率(18.2%vs 22.4%)等方面差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。結論與程序化法比較，玻璃化法可以提高累積妊娠率，是一種高效胚胎凍融方法。

程序化冷凍；玻璃化冷凍；累積妊娠率

玻璃化冷凍是近年來出現(xiàn)的新型冷凍方法，與程序化法相比，它簡便、高效，正逐步成為主要的胚胎冷凍方法[1]。然而，有關這兩種方法在人卵裂期胚胎凍融方面的臨床報道很少[2-5]，特別是未見它們對單次取卵周期累積妊娠率影響的報道。本文回顧性分析這兩種方法在凍融卵裂期胚胎移植周期累積妊娠率方面的效果差異。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 回顧性分析本中心于2007年7～12月冷凍、截止2010年12月全部復蘇完畢的271個凍融周期，女方患者22～42歲，平均(31.6±4)歲。根據冷凍方法分為兩組：(1)程序冷凍組78例，92個復蘇周期；(2)玻璃化冷凍組114例，179個復蘇周期。納入標準：①不孕因素為少弱精子癥和/或輸卵管因素；②促排卵方案為抑那通長方案降調節(jié)，國產人絕經期促性腺激素(HMG)為主要促排卵藥(根據卵泡生長情況添加少量麗申寶)；③實驗室條件穩(wěn)定，試劑均為Quinn's系列；④常規(guī)體外受精或胞漿內單精子注射受精，而且二者比例相同；⑤兩組的平均年齡、不孕年限、平均凍胚數等差異均無統(tǒng)計學意義，隨機分配入組；⑥復蘇周期均為第3天冷凍胚胎移植，且新鮮周期均未孕；⑦兩組均因解凍、妊娠等情況已無剩余凍胚。兩組的平均年齡、不孕年限、平均凍胚數等指標比較差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，見表1。

表1 兩種凍胚方法基本情況比較（±s）

表1 兩種凍胚方法基本情況比較（±s）

項目 程序凍胚 玻璃化凍胚P新鮮周期數(例)平均年齡(歲)平均獲卵數(個)獲胚率（%）平均凍胚數(個)78 31.7±4 16.4±6 72.1(925/1283)5.8±2.6(454)114 31.5±3.9 17.5±6.7 73.2(1461/1995)5.9+3.2(678)＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05

1.2 方法

1.2.1 胚胎凍融標準 將第3天胚胎根據形態(tài)學參數分為4級[6]，評分為Ⅰ～Ⅲ級的剩余胚胎進行冷凍。優(yōu)質胚胎標準為有平整、規(guī)則、球形的卵裂球，適度的折光和完整的透明帶，卵裂球大小相同或略有不同，碎片小于20%，≥6細胞。復蘇后胚胎分類標準是以存活細胞數為主，參考其他形態(tài)學參數分類如下：原樣胚胎：100%的細胞存活；良好胚胎：細胞存活數超過50%；差胚胎：細胞存活數少于50%；壞死胚胎：細胞無存活。用于移植的胚胎標準為有超過50%的卵裂球存活。

1.2.2 程序法

1.2.2.1 冷凍[7]室溫下，將胚胎放入含20%人白蛋白的HEPES緩沖液中輕洗數次，依次轉入1.5 mol/L丙二醇(PROH)液、1.5 mol/L PROH+0.1 mol/L蔗糖液中(分別為10 min、5 min)。裝管(每根凍貯麥管裝入1～4個胚胎)，封口后程序降溫。即以-2℃/min的速度從20℃降至-6℃，在-6℃停留5 min后植冰，再在-6℃繼續(xù)停留5 min，然后以-0.3℃/min的速度從-6℃降至-30℃，再以-10℃/min的速度從-30℃降至-120℃。程序運行結束后，立即按登記指定的位置投入液氮罐保存。

1.2.2.2 解凍 從液氮中取出冷凍管，驗證標簽。在室溫空氣中搖動停留30 s，37℃水浴中至完全融化。剪斷冷凍管，將胚胎吹入1.5 mol/L PROH+0.1 mol/L蔗糖的溶液中，然后將胚胎分別移至0.5 mol/L蔗糖、0.2 mol/L蔗糖的復蘇液及含20%人白蛋白的HEPES緩沖液中各5 min，轉入培養(yǎng)液置培養(yǎng)箱中待移植。

1.2.3 玻璃化法[3]

1.2.3.1 配制凍融液 A液：20%人血清白蛋白的HTF-HEPES；B液：含1 M蔗糖的A液（10 mlA液+3.48 g蔗糖），解凍液1；ES液：含7.5%乙二醇(EG)+7.5%二甲亞砜(DMSO)的A液；VS液：含15%EG＋15%DMSO的B液；解凍液2：0.5 M蔗糖濃度，由A、B液各半組成；解凍液3：0.25 M蔗糖濃度，由1/4B液+3/4A液組成。

1.2.3.2 冷凍 將胚胎在A液中輕洗數次，轉入ES液，至胚胎復原體積90%時，轉入VS液中45～60 s，裝入冷凍葉片，快速投入液氮后，再在液氮內移入5 ml冷凍管內保存。

1.2.3.3 復蘇 從液氮中取出冷凍管，驗證標簽。將胚胎快速移入37℃B液1 min，然后在室溫下將胚胎分別移入解凍液2、解凍液3、A液各3 min、5 min、5 min。轉入培養(yǎng)皿待移植。

1.2.4 胚胎移植 采用自然周期或激素替代周期準備子宮內膜，復蘇后半小時，選擇質量較好的1～3個胚胎移植。移植后14 d測尿人絨毛膜除性腺激素（HCG）陽性者為生化妊娠，第30天后B超檢查見到孕囊為臨床妊娠。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0軟件包進行統(tǒng)計分析，計數資料比較應用χ2檢驗；計量資料的樣本均數兩組比較用t檢驗。α=0.05作為統(tǒng)計檢驗水準，P＜0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 胚胎復蘇結果比較 如表2所示，除胚胎丟失率(P＞0.05)差異無統(tǒng)計學意義之外，玻璃化法組的存活率、復蘇后胚胎形態(tài)等多項指標均明顯優(yōu)于程序化法組(P＜0.01)。另外，因胚胎復蘇或患者妊娠棄胚等情況，程序化法組共丟棄凍胚54個，玻璃化法組丟棄凍胚255個。

表2 程序冷凍與玻璃化凍胚復蘇效果比較(±s)

表2 程序冷凍與玻璃化凍胚復蘇效果比較(±s)

項目 程序法 玻璃化法P總復蘇周期數（周）移植周期取消率（%）解凍胚胎數(個)平均解凍胚胎數（±s，個）存活率（%）復蘇后胚胎[個（%）]原樣良好胚胎差或壞死胚胎丟失92 15.2(14/92)400 4.3±1.7 59.3(237/400)1790423 2.4±0.7 94.3(399/423)＜0.01＜0.01＜0.01 145(36.3)92(23)143(35.7)20(5)378(89.4)22(5.2)11(2.6)12(2.8)＜0.01＜0.01＜0.01＞0.05

2.2 臨床結局比較 如表3所示，與程序冷凍法相比，玻璃化法在胚胎植入率、周期妊娠率等方面差異均無統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，但累積臨床妊娠率差異有統(tǒng)計學意義(0.01＜P＜0.05)。隨訪表明兩組幼兒均健康狀況良好。

表3 臨床結局比較

3 討論

玻璃化冷凍是近年來生殖醫(yī)學領域的研究熱點，它的基本原理是采用高濃度的冷凍保護劑，將生物細胞超快速的降溫至-196℃，使細胞內外水分不形成冰晶而直接轉變?yōu)椴ＡB(tài)，避免對細胞內部結構的損傷，使其保持存活狀態(tài)。目前在玻璃化冷凍技術中，為達到玻璃化冷凍的目的，常采用開放式載體和最小體積法來增加降溫速率。與復雜的封閉式程序化冷凍相比，此方法簡便、經濟、胚胎復蘇率高，但由于它屬于開放式冷凍，胚胎與液氮直接接觸，所以存在潛在生物污染的可能性。本文將主要從以下幾個方面比較這兩種方法的差異：

3.1 凍融效果比較 與程序化法相比，玻璃化法的胚胎存活率(94.3%vs 59.3%)和復蘇完整胚胎率(89.4%vs 36.3%)均較高，與Balaban等[5]報道一致。這可能與下列因素有關：程序化法使用的載體是0.25ml冷凍麥管，裝載液體體積較大，約50～1 000μl；全程需程序降溫儀分階段降溫，胚胎與冷凍保護劑接觸時間長，約2～3 h；在冷凍過程中易形成大量冰晶，常導致降復溫過程中胚胎內部結構受損，因此胚胎復蘇率較低(50%～70%)。若在運行過程中出現(xiàn)儀器故障，將會給胚胎帶來不可挽回的損傷。而玻璃化法載體為冷凍葉片裝載體積小，僅為0.5～1.0μl；冷凍時只需將載體直接投入液氮冷凍即可，胚胎與冷凍保護劑接觸的時間較短；降溫過程中不形成冰晶，胚胎復蘇高(≥90%)；每個載桿單獨操作，失誤率低。因此，通過玻璃化凍融，可以更大限度地保存胚胎，增加凍融胚胎移植周期數，從而增加單次取卵周期的累積妊娠率。

3.2 單次取卵周期累積妊娠率 就周期臨床妊娠率和植入率來說，兩組差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，這與Kuwayama[8]報道一致，但本文數據也顯示玻璃化法的累積妊娠率較高(0.01＜P＜0.05)。原因可能是：①在相同數量和胚胎級別的情況下，程序化凍融胚胎損傷大、周期取消率高，因此復蘇周期次數少；而玻璃化法胚胎損傷小，復蘇后優(yōu)質胚胎率高，周期取消率低或無取消周期，利于節(jié)約胚胎，增加復蘇周期次數，因此累積妊娠率高。②玻璃化法凍融過程中，雖然部分胚胎復蘇后外形很好，但其發(fā)育潛能可能已經受損或喪失，無法繼續(xù)發(fā)育，所以單次復蘇周期臨床妊娠率不一定高。

3.3 臨床妊娠結局 玻璃化法是一種新型的技術，但是缺乏大量的臨床數據來說明它的有效性和安全性，尤其是相對缺乏有關第3天卵裂期胚胎的妊娠數據。而來源于國產HMG促排卵方案的胚胎凍融資料則未見報道。

我們的數據顯示玻璃化法與程序化法在胚胎植入率、流產率及宮外孕率等方面差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。原因之一為程序化凍融法雖然對胚胎損傷大，但是能夠存活的胚胎一般質量較好，因此與玻璃化法中存活的優(yōu)質胚胎一樣均有較好的發(fā)育潛能。另外，這兩組凍融方法所出生的嬰兒均無核型異常及出生缺陷，這在一定程度上說明了玻璃化法的可行性。

綜上所述，與程序化凍融法相比，玻璃化凍融法操作簡單、胚胎復蘇率高，有利于增加累積妊娠率；更利于單胚冷凍及全胚冷凍；便于安全、自然、低劑量藥物的促排卵方案的實施，因此它具有十分廣闊的臨床應用前景和價值。

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Influence of two embryo freezing methods on cumulative pregnancy rate.

MI Zu-xia,LU Wei-ying,XU Wen.Department of Human Reproductive Center,the Affiliated Hospital of Hainan Medical College,Haikou 570102,CHINA

ObjectiveTo evaluate the impact of two embryo freezing methods on cumulative pregnancy rate.MethodsSeventy-eight patients

92 F-ET cycles of slow freezing(group A),and 114 patients received 179 F-ET cycles in vitification warmed(group B).After warming,the survival rate,cumulative clinical pregnancy rates were compared between the two groups.ResultsThe survival rate(94.3%vs 53.9%,P＜0.01),the post-warmed excellent morphology with all blastomeres intact(89.4%vs 36.3%,P＜0.01),the cumulative pregnancy rate(28.2%vs 43%,0.01＜P＜0.05)showed statistically significant difference between group B and group A.No statistically significant difference were found in the implantation rates(13.7%vs 13.5%),abortion rates(18.2%vs 22.4%)between the two groups(P＞0.05).ConclusionIn contrast to slow freezing,Vitrification provides a higher cumulative pregnancy rate,which serves as an efficient method for the cryopreservation of human cleavage stage embryos.

Slow freezing;Vitrification;Cumulative pregnancy rate

R197.323

A

1003—6350（2012）16—038—03

2012-02-21)

10.3969/j.issn.1003-6350.2012.16.014

秘祖霞(1976—)，女，山東省陽信市人，助理研究員，碩士。

*通訊作者：徐 雯：E-mail：lijunxuwen@sohu.com