單立平，卜仁戈，張墨，李波，吳斌，宋永勝

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院泌尿外科，沈陽(yáng) 110004）

上皮特異性黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）是常見(jiàn)的上皮細(xì)胞黏附分子，與尿路上皮癌細(xì)胞的侵襲力密切相關(guān)［1］；E-鈣黏素（ECadherin）是一腫瘤浸潤(rùn)抑制分子，與尿路上皮癌分化狀態(tài)有關(guān)［2］。但二者在腎盂腫瘤中表達(dá)的關(guān)系及作用機(jī)制研究較少。因此本研究采用免疫組化SP法檢測(cè)EpCAM和E-Cadherin在癌組織中的表達(dá)，探討二者在腎盂癌浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制和診斷價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 一般資料

76例腎盂癌石蠟包埋標(biāo)本（2002年6月-2010年6月）取自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院病理科，所有標(biāo)本術(shù)前均未行放化療?；颊咧心?0例，女26例，年齡38～87（平均年齡64.3）歲。病理分級(jí)按WHO 2004年分級(jí)法，低分級(jí)乳頭狀尿路上皮癌35例，高分級(jí)乳頭狀尿路上皮癌41例。腎盂癌分期按照按照國(guó)際抗癌協(xié)會(huì)2002年版TNM分期法，36例為非肌層浸潤(rùn)性腎盂癌（pT1或pTa），40例為肌層浸潤(rùn)性腎盂癌（pT2，pT3或pT4）。距腫瘤邊緣 2～3 cm處鉗取上皮黏膜組織，行病理檢查顯示無(wú)癌細(xì)胞浸潤(rùn)，設(shè)定為癌旁黏膜組織。選取50例患者癌旁黏膜組織，設(shè)為對(duì)照組。例平均隨訪(fǎng)64（24～108）個(gè)月，隨訪(fǎng)患者接受膀胱鏡檢查、胸部X線(xiàn)檢查、腹部超聲檢查、泌尿系CT檢查及骨掃描檢查，將檢查發(fā)現(xiàn)體內(nèi)有其他臟器、淋巴結(jié)或骨轉(zhuǎn)移設(shè)定為遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。隨訪(fǎng)顯示遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移39例，復(fù)發(fā)平均時(shí)間16（6～28）個(gè)月；術(shù)后膀胱癌再發(fā)22例，平均發(fā)病時(shí)間19（8～35）個(gè)月。

1.2 試劑

兔抗人E-cadherin多克隆抗體（美國(guó)Santa Cruz公司），鼠抗人EpCAM抗體（美國(guó)Santa Cruz公司），免疫組化SP試劑盒（美國(guó)Zymed公司），DAB顯色劑（北京中山生物技術(shù)有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化：所有標(biāo)本均經(jīng)4%甲醛固定，石蠟包埋組織連續(xù)切片（厚4 μm），每例標(biāo)本分別做常規(guī)HE、免疫組織化學(xué)染色。免疫組織化學(xué)SP法分別標(biāo)記EpCAM和E-Cadherin，操作步驟按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。DAB顯色，蘇木素復(fù)染核。PBS代替第一抗體作陰性對(duì)照，光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.3.2 評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：EpCAM陽(yáng)性表達(dá)在癌細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，呈棕黃色顆粒，均勻彌漫性分布，所有上皮來(lái)源的腫瘤EpCAM均不同程度陽(yáng)性。EpCAM陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)［3］：于高倍鏡下計(jì)數(shù)100個(gè)上皮細(xì)胞，以胞質(zhì)染色陽(yáng)性細(xì)胞>25%為EpCAM陽(yáng)性。E-Cadherin陽(yáng)性結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)［4］：以細(xì)胞膜或胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性，腫瘤細(xì)胞染色＜90%被判定為陰性，＞90%判定為陽(yáng)性。細(xì)胞記數(shù)標(biāo)準(zhǔn)參照Tomomi Ishida的記數(shù)標(biāo)準(zhǔn)，40×物鏡視野下共查100個(gè)細(xì)胞，查10個(gè)視野。以上均由3位病理醫(yī)生用盲法對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行評(píng)估，切片號(hào)碼為隨機(jī)確定，與臨床病理資料無(wú)對(duì)應(yīng)關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)數(shù)資料用χ2檢驗(yàn)，等級(jí)分組資料的相關(guān)性用Spearman等級(jí)相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EpCAM和E-Cadherin在腎盂癌和癌旁組織中的表達(dá)

EpCAM在腎盂癌中陽(yáng)性表達(dá)率為60.5%（46/76），高于癌旁組織 16.0%（8/50），二者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。腎盂癌組織E-Cadherin陽(yáng)性表達(dá)率為27.6%（21/76），低于癌旁組織56.0%（28/50），二者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 EpCAM和E-Cadherin在癌組織和癌旁組織中的表達(dá)Tab.1 Expressions of EpCAM and E-Cadherin in normal mucosa and urothelial carcinoma of renal pelvis

2.2 腎盂癌組織中EpCAM與E-Cadherin蛋白表達(dá)與病理分級(jí)和臨床分期關(guān)系

EpCAM高表達(dá)率隨著腎盂癌臨床分期的增高而升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；E-Cadherin的表達(dá)隨著臨床分期的增高而下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。EpCAM高表達(dá)率隨腫瘤病理分級(jí)的增高而升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；Ep－CAM高表達(dá)率隨腫瘤病理分級(jí)的增高而降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。免疫組化染色顯示，在高分級(jí)尿路上皮癌標(biāo)本中，可見(jiàn)較為典型的EpCAM高表達(dá)，在非肌層浸潤(rùn)性腎盂癌中可見(jiàn)典型E-Cadherin陽(yáng)性表達(dá)。見(jiàn)圖1。

2.3 腎盂癌中EpCAM與E-Cadherin的表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系

EpCAM表達(dá)在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組明顯高于無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），在繼發(fā)膀胱腫瘤患者中表達(dá)上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與性別及年齡均無(wú)明顯相關(guān)性，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。E-Cadherin表達(dá)在無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組表達(dá)明顯高于有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），在繼發(fā)膀胱腫瘤患者中表達(dá)下調(diào)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而與性別、年齡及復(fù)發(fā)均無(wú)明顯相關(guān)性，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.4 EpCAM與E-Cadherin表達(dá)的關(guān)系

46例EpCAM表達(dá)陽(yáng)性組織中有E-Cadherin表達(dá)陽(yáng)性5例，表達(dá)陰性41例。30例EpCAM表達(dá)陰性組織中E-Cadherin表達(dá)陽(yáng)性16例，表達(dá)陰性14例。二者在腎盂癌中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（r=-0.425，P<0.01）。

3 討論

EpCAM屬于黏附分子家族，是由腫瘤相關(guān)鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)1基因編碼的一個(gè)單次跨膜蛋白，不同程度地表達(dá)于大多數(shù)的正常上皮細(xì)胞中［1］。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，EpCAM 在乳腺癌［5］、腸癌［6］、卵巢癌［7］、膀胱癌［1］和腎盂癌［3］等多種上皮性腫瘤中表達(dá)，并與腫瘤的分級(jí)、分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，EpCAM通過(guò)上調(diào)c-myc、cyclin A/E等基因的表達(dá)，直接刺激細(xì)胞循環(huán)，促進(jìn)細(xì)胞增殖［8］。本研究證實(shí)，EpCAM在腎盂癌組織中陽(yáng)性表達(dá)，表達(dá)率明顯高于癌旁正常組織，并在腫瘤的高級(jí)別病理、浸潤(rùn)性腫瘤、遠(yuǎn)隔轉(zhuǎn)移和術(shù)后繼發(fā)膀胱腫瘤中表達(dá)明顯升高，提示EpCAM與腎盂癌的發(fā)生、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，EpCAM高表達(dá)提示腫瘤侵襲能力強(qiáng)、預(yù)后不良。

表2 腎盂癌中EpCAM與E-Cadherin表達(dá)與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系（n=76）Tab.2 Expressions of EpCAM and E-cadherin and their correlation in urothelial carcinoma of renal pelvis（n=76）

EpCAM能夠削弱E-Cadherin介導(dǎo)的細(xì)胞間的黏附作用，E-Cadherin作為一種鈣依賴(lài)性細(xì)胞黏附分子，可介導(dǎo)同型細(xì)胞連接以及維持細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)完整性，E-Cadherin表達(dá)的下調(diào)加速上皮層腫瘤細(xì)胞自脫落，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的淋巴轉(zhuǎn)移［9］。在腎盂癌中，EpCAM表達(dá)上調(diào)，E-Cadherin表達(dá)下調(diào)，并均與臨床分期、病理分級(jí)和淋巴轉(zhuǎn)移存在明顯相關(guān)性，提示EpCAM高表達(dá)和E-Cadherin低表達(dá)均可加速上皮層腫瘤細(xì)胞自脫落，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的淋巴轉(zhuǎn)移，檢測(cè)EpCAM高表達(dá)和E-Cadherin低表達(dá)提示淋巴轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)較高。本研究提示：E-Cadherin表達(dá)在術(shù)后繼發(fā)膀胱癌患者中表達(dá)下調(diào)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），可能與本研究病例數(shù)相對(duì)較少，引起的統(tǒng)計(jì)學(xué)誤差有關(guān)。本研究提示腎盂癌中EpCAM和E-Cadherin表達(dá)呈明顯負(fù)相關(guān)，聯(lián)合檢測(cè)EpCAM和E-Cadherin可以判斷腎盂腫瘤的預(yù)后。

EpCAM還表達(dá)于腫瘤干細(xì)胞的后代細(xì)胞上，針對(duì)EpCAM為靶點(diǎn)的藥物，具有特異性殺傷效應(yīng)，有可能發(fā)現(xiàn)和根除EpCAM高表達(dá)腫瘤干細(xì)胞［10］，使其失去向腫瘤分化的能力。目前腎盂癌的治療方案比較單一，主要是手術(shù)切除和化療，浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移性腎盂癌預(yù)后較差，而針對(duì)EpCAM的靶向治療可以為浸潤(rùn)性腎盂癌提供新的治療方案。

總之，EpCAM高表達(dá)和E-Cadherin低表達(dá)與腎盂癌的發(fā)生、浸潤(rùn)和淋巴轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，聯(lián)合檢測(cè)對(duì)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移能力判斷具有一定價(jià)值，EpCAM靶向藥物可能為浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的治療提供新思路。

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