韓文蓮 宋金玲

湖北省襄陽市食品藥品檢驗所，湖北襄陽 441021

紅花注射液為活血化瘀、消腫止痛藥，主要用于治療閉塞性腦血管疾病、冠心病、心肌梗死、脈管炎；對高脂血癥、糖尿病并發(fā)癥、月經(jīng)不調(diào)、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等有輔助治療作用。臨床多采用靜脈滴注的方法給藥。文獻規(guī)定[1]：某些中藥注射劑，由于含有溶血成分或物理、化學(xué)及生物等方面的原因，在直接注入血管后可產(chǎn)生溶血作用；也有些注射劑中因含有雜質(zhì)等成分，注入血管后可產(chǎn)生血細胞凝聚，引起血液循環(huán)功能障礙等不良反應(yīng)；另外，因中藥制劑的成分復(fù)雜，也存在因免疫反應(yīng)引起的免疫性溶血。因此凡是注射劑和可能引起免疫性溶血和非免疫性溶血反應(yīng)的其他藥物制劑均應(yīng)進行溶血性試驗。紅花注射液雖已在臨床應(yīng)用，但其原質(zhì)量標(biāo)準中未設(shè)立溶血與凝聚檢查項。本文通過對中藥紅花注射液溶血和凝聚試驗的研究，為臨床用藥安全提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試藥與儀器

紅花注射液（規(guī)格：5 mL/支，十堰金鼎制藥有限公司，批號：110401），80-1離心機（上海手術(shù)器械廠），紫外分光光度計UV-2012PC（尤尼柯上海儀器有限公司）。

1.2 動物

大耳白兔，體重3.0 kg供采血（湖北襄陽動物養(yǎng)殖中心）。

2 方法

2.1 2%紅細胞混懸液的制備

家兔耳緣靜脈取血，放入有玻璃珠和抗凝劑的三角瓶中振搖10 min除去纖維蛋白原，使成脫纖血液，加入0.9%氯化鈉溶液約10倍量，搖勻，于離心機中1 500 r/min離心10 min，除去上清液，沉淀的紅細胞再用0.9%氯化鈉溶液按上述方法洗滌3次，至上清液不顯紅色為止[2]。將所得紅細胞用0.9%氯化鈉溶液配成2%的混懸液，備用，并于當(dāng)天使用。

2.2 溶液制備

取紅花注射液 0.1、0.3、0.5、0.8、1.1 mL，加到試管中平行做3只管，加入無菌0.9%氯化鈉溶液補充總體積至2.5 mL，再依次加入2%的紅細胞混懸液2.5 mL作為供試品管[3]。陰性對照管加入無菌0.9%氯化鈉溶液2.5 mL和2%的紅細胞混懸液，陽性對照管加入蒸餾水2.5 mL和2%的紅細胞混懸液，再取4.7 mL 0.9%氯化鈉溶液加0.3 mL的供試品作為供試品的對照管[1，4]。

2.3 肉眼觀察

將試管放入（37±0.1）℃恒溫箱中進行保溫，開始每15分鐘觀察1次，1 h后，每隔1 h觀察1次，3 h后取出試管，對陽性對照管、陰性對照管、每組供試品管及其供試品對照管進行肉眼觀察。試管中的溶液呈澄明紅色，管底無細胞殘留或有少量紅細胞殘留，表明有溶血發(fā)生；如紅細胞全部下沉，上清液無色澄明，或上清液雖有色澄明，各管肉眼觀察無明顯差異，則表明無溶血發(fā)生。若溶液中有棕紅色或棕紅色絮狀沉淀，輕輕振搖仍不能分散，則表明有紅細胞凝聚發(fā)生，應(yīng)進一步置顯微鏡下觀察[4]。

2.4 分光光度法

根據(jù)紅細胞破裂釋放出的血紅素在575 nm波長處有最大吸收[5]，取各管的上清液置于比色管中，來測定紅花注射液的溶血度。將在（37±0.1）℃恒溫1 h后的各管取出，在1 500 r/min離心5 min，上清液取于比色管中，以陰性管作為空白，在575 nm處測得各管的吸光度[6]。

溶血度（%）=（A試驗管-A陰性管）/（A陽性管-A陰性管）×100%。式中：A試驗管為試驗管吸光度，A陰性管為陰性對照管吸光度，A陽性管為陽性對照管吸光度。

3 結(jié)果

3.1 肉眼觀察法測紅花注射液溶血結(jié)果

通過與陰性對照管、陽性對照管、樣品對照管各管之間的比較后，各管之間肉眼觀察區(qū)別不大。結(jié)果見表1。

表1 肉眼觀察法測紅花注射液溶血結(jié)果

由表1可見，蒸餾水對照管（陽性對照管）因體系不等滲而致紅細胞破裂發(fā)生溶血，形成紅色澄明溶液，0.9%氯化鈉溶液對照管（陰性對照管）與各被試管在觀察的時間內(nèi)均無溶血及紅細胞凝集發(fā)生[7]。

3.2 分光光度法溶血測定結(jié)果

對本批紅花注射液的溶血度用分光光度法測定的結(jié)果見表2。

表2 分光光度法溶血測定結(jié)果

4 討論

《中國藥典》[4]規(guī)定了采用肉眼觀察法對中藥注射液溶血進行觀察，適用于溶血較明顯的樣品，但有些中藥注射液本身的顏色和部分紅細胞破裂后釋放出的血紅色素，對結(jié)果判斷會產(chǎn)生影響。

《藥物研究技術(shù)指導(dǎo)原則》[1]中指出溶血反應(yīng)發(fā)生的機制復(fù)雜，目前尚無標(biāo)準的臨床前體內(nèi)試驗以全面評價藥物制劑的溶血反應(yīng)。實驗時應(yīng)注意觀察溶血反應(yīng)的有關(guān)指標(biāo)及體征，如出現(xiàn)溶血時應(yīng)進行進一步研究。還對分光光度法測定溶血試驗的參考指標(biāo)明確指出，當(dāng)溶血率＞5%時，不宜用于靜脈注射。根據(jù)紅細胞破裂釋放的血紅素在575 nm有最大吸收的原理[5]，利用分光光度法進行溶血性試驗操作時，應(yīng)注意離心的速度及溫度對試驗結(jié)果的影響。可能有些藥物分子及附加劑在離心時與紅細胞發(fā)生碰撞的力量較大，若離心速度較快，易導(dǎo)致非藥物溶血現(xiàn)象的出現(xiàn)。此外，因不同的中藥注射劑顏色及深淺不同，若其色澤對血紅素的最大吸收有干擾，則應(yīng)注意排除非藥物因素的影響[8]。因本品紅花注射液為棕黃色的液體，特設(shè)一底色組，用樣品的吸光度減去底色組的吸光度的差值，提高實驗的準確度。在本實驗中，紅花注射液在恒溫 （37±0.1）℃溫育1 h后肉眼觀察無明顯溶血現(xiàn)象，在1 500 r/min離心5 min，取上清液于比色皿中，紫外分光光度法檢測溶血度均小于5%，因此從溶血標(biāo)準上認為本品可以作為靜脈注射用。通過兩種方法的比較認為采用分光光度法測定中藥注射劑的溶血程度，具有操作簡便、穩(wěn)定性好、能消除常規(guī)試管觀察法帶來的主觀誤差等優(yōu)點，對臨床安全用藥有重要的指導(dǎo)意義。

[1]國家食品藥品監(jiān)督管理局.藥物研究技術(shù)指導(dǎo)原則（中藥·天然藥物刺激性和溶血性研究的技術(shù)指導(dǎo)原則）[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2005：230.

[2]稽揚，王文俊，沈娟，等.注射用七葉皂苷鈉的體外溶血與凝聚試驗[J].中國藥品標(biāo)準，2008，4（9）：284-286.

[3]陳奇.中藥藥理研究方法學(xué)[M].3版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2011.

[4]國家藥典委員會.中國藥典（一部）[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄 92.

[5]張劍鋒，項崢，竇德強.血塞通注射液溶血檢測方法研究[J].中國現(xiàn)代中藥，2011，1（13）：34-38.

[6]楊光，項崢，康延國，等.人參皂苷溶血測定的實驗條件研究[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2008，10（6）：190-191.

[7]王秋菊，呂娟，梁晨，等.注射用三磷酸胞苷二鈉的溶血性、過敏性及血管刺激性研究[C].中國藥學(xué)會學(xué)術(shù)年會暨第八屆中國藥師周論文集，2008.

[8]章寶娟.中藥注射劑溶血性試驗方法的研究概述[J].海峽藥學(xué)，2007，8（19）：79-81.