程明國 沈若武 王守彪 夏玉軍

1.青島大學醫(yī)學院人體解剖學教研室，山東青島 266041；2.青島市第三人民醫(yī)院骨外科，山東青島 266041

骨髓炎是一組細菌感染骨髓、骨皮質(zhì)和骨膜而引起的炎性疾病。機體免疫狀態(tài)對骨髓炎的發(fā)生發(fā)展影響很大，一些研究證實骨髓炎時出現(xiàn)T和B淋巴細胞功能的障礙[1-2]，而關于其免疫調(diào)節(jié)狀態(tài)還有許多不明之處。近年來研究發(fā)現(xiàn)，機體內(nèi)存在著一群新型的不同于已知的Th17、Th1、Th2和Treg的CD4+Th細胞亞群，具有分泌IL-9和IL-10的能力，稱之為Th9細胞[3-4]。目前，尚未見Th9細胞與骨髓炎有關的報道。本文旨在通過研究骨髓炎患者局部組織中Th9細胞效應因子IL-9、IL-10的含量，探討Th9細胞在骨髓炎發(fā)病中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

大耳白兔20只，體重2.2～2.5 kg，雌雄不限，購于山東魯抗醫(yī)藥公司動物中心（許可證號scxk魯20080011）。將動物隨機分為手術組（n=10），假手術組（n=5）和對照組（n=5）。

1.2 主要試劑

IL-9和IL-10單克隆抗體（兔抗鼠），即用型SABC試劑盒等，購于武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 建立兔脛骨近端骨髓炎模型

10%水合氯醛（500 mg/kg）腹腔注射麻醉，取仰臥位，無菌條件下取右脛骨髕內(nèi)下縱切口，長約4 cm。切開皮膚、皮下，顯露脛骨近端內(nèi)側(cè)，用3 mm鉆頭的手鉆，在該處鉆3個縱向相連、部分重疊的骨洞。用小刮匙刮除松質(zhì)骨，修整骨洞邊緣，制成一1.0 cm×0.5 cm的矩形骨窗。于骨窗內(nèi)注入5×106CFU/mL金葡球菌0.5 mL及魚肝油酸鈉50 g/L 0.5 mL，10 min后用骨蠟將骨窗封閉，反復沖洗后縫合傷口[5]，術后回籠常規(guī)喂養(yǎng)2周后處死。假手術組僅顯露脛骨，然后關閉切口。正常對照組不做任何處理。

1.4 HE染色及免疫組織化學染色觀察

術后2周腹腔注射麻醉后，在無菌條件下切取兔右脛骨近端骨窗上下約2 cm，縱行剖成兩半后用4%多聚甲醛固定24 h、20%EDTA脫鈣脫鈣、浸蠟包埋、連續(xù)切片。應用免疫組織化學SABC三步法染色，檢測IL-9、IL-10的表達，DAB顯色，鏡下控制顯色時間。最后脫水，透明，封片，顯微鏡觀察。

1.5 免疫組化染色結(jié)果分析

細胞漿內(nèi)黃褐色或棕褐色顆粒即為免疫組化染色陽性結(jié)果。利用德國Sample PCI圖象分析系統(tǒng)對免疫組化染色結(jié)果進行光吸收密度測量分析，將免疫組化染色結(jié)果轉(zhuǎn)化為光吸收密度值進行定量分析。每張切片測定5個視野取平均吸光度值，以其作為切片的測定值。

1.6 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 11.0統(tǒng)計分析軟件進行分析處理。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示。兩組間比較應用t檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 HE染色結(jié)果

正常對照組及假手術組骨組織內(nèi)只有少量中性粒細胞、T淋巴細胞及巨噬細胞等浸潤，炎癥反應不明顯，無壞死區(qū)域。手術組骨組織內(nèi)可見大量的中性粒細胞、淋巴細胞、巨噬細胞的聚集，骨質(zhì)呈灶性壞死及片狀壞死區(qū)，并可見纖維結(jié)締組織增生。

2.2 IL-9、IL-10的免疫組化染色結(jié)果

正常對照組及假手術組骨組織內(nèi)IL-9、IL-10陽性表達較弱，而手術組則呈強陽性表達，淋巴細胞漿內(nèi)可見黃褐色或棕褐色顆粒，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；結(jié)果見表1。

表1 各組局部骨組織內(nèi)IL-9、IL-10的免疫組化染色的平均光密度值（±s）

表1 各組局部骨組織內(nèi)IL-9、IL-10的免疫組化染色的平均光密度值（±s）

注：與正常組、假手術組比較，#P<0.05

組別 例數(shù)（n） IL-9 IL-10正常組假手術組手術組5 5 1 0 0.221±0.011 0.315±0.013 1.024±0.313#0.219±0.031 0.268±0.043 1.356±0.487#

3 討論

骨髓炎是目前骨科臨床上較常見的難治性疾病。目前，對骨髓炎的治療措施主要有加強全身營養(yǎng)及大量應用抗生素，置管沖洗，適時采用徹底清創(chuàng)取出死骨，局部肌瓣填塞等。然而這些方法都難以取得滿意的療效，許多學者認為，改善局部血供和充分發(fā)揮機體在局部的免疫功能可能是解決問題的關鍵[6]。機體的抗細菌感染免疫主要依靠T、B淋巴細胞及相關輔助細胞發(fā)揮的適應性免疫，所以有關骨髓炎的免疫調(diào)節(jié)日益受到重視。

Th9細胞由TGF-β和IL-4誘導，其不同于已知的Th1、Th17、Th2和Treg，是一種能分泌IL-9、IL-10的新型的CD4+效應T細胞亞群[7]。Th9細胞發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的主要效應因子是IL-9，它通過與各類效應性T細胞或其他細胞因子的相互作用發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能。IL-9可作用于不同的炎癥細胞，如T、B淋巴細胞、肥大細胞、中性粒細胞，使得炎癥細胞的數(shù)量增加并分泌一些炎癥介質(zhì)，促進炎癥的發(fā)生[8]。此外，IL-9還可作用于組織細胞，在許多疾病的發(fā)生發(fā)展中起關鍵作用[9]。本文研究顯示：骨髓炎的局部骨組織中IL-9的表達明顯高于正常組，說明IL-9在骨髓炎疾病改變中起到重要的炎性介質(zhì)作用，加速了炎癥病變的進展速度，這與目前IL-9在其他組織器官的慢性炎癥中的研究結(jié)果相似。

Th9細胞除了IL-9這個效應因子外，還分泌IL-10。IL-10是一種有效的抗炎因子，在病原微生物的感染中發(fā)揮著免疫調(diào)節(jié)作用，一直以來作為抗炎因子被廣泛關注。IL-10還可由B細胞、單核/巨噬細胞、角化細胞和腫瘤細胞及人Th2細胞分泌產(chǎn)生，并能夠抑制炎性反應，限制炎癥的發(fā)展[10]。本文研究顯示骨髓炎的局部骨組織中IL-9的表達明顯高于正常組，這與其他學者的研究結(jié)果相似[11-12]。IL-10在骨髓炎的局部骨組織中的高表達，可能是因為機體對維持促炎性細胞因子與抑炎性細胞因子之間的平衡做出的自身調(diào)節(jié)。促炎性細胞因子與抑炎性細胞因子之間的平衡是維持正常免疫狀態(tài)的基礎，這也說明骨髓炎局部組織中存在著抑制促炎性細胞因子的過高表達。

綜上所述，筆者認為Th9細胞在骨髓炎發(fā)病中起到了重要的免疫調(diào)節(jié)作用，雖然IL-10在骨髓炎的局部骨組織中高表達，但IL-9才是Th9細胞發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的主要效應因子，所以筆者認為Th9細胞在骨髓炎發(fā)病中起到了促進炎癥發(fā)生的作用。

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