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        加味四逆散對肝星狀細胞增殖的實驗研究*

        2012-09-06 10:56:44鄭旭銳李長秦季金文王禮鳳孫守才王小平肖新春陜西中醫(yī)學院咸陽712046
        陜西中醫(yī) 2012年1期
        關(guān)鍵詞:鱉甲肝片復(fù)方

        鄭旭銳 李長秦 季金文 王禮鳳 孫守才 宋 健 王小平 肖新春 陜西中醫(yī)學院(咸陽 712046)

        加味四逆散是抗肝纖維化有效的中藥復(fù)方,我們在前期的研究中已經(jīng)證實其具有良好的抗肝纖維化作用[1-5],為了進一步探討其抗肝纖維化的機制,我們此次以肝星狀細胞(HSC)為靶點,研究該方對HSC增殖的影響。

        1 實驗材料與方法 1.1 實驗材料 1.1.1 實驗動物:雌性SD大鼠30只,清潔級,體重180g±20g,購自第四軍醫(yī)大學實驗動物中心。動物合格證號:SCXK-(軍)2007-007。

        1.1.2 主要實驗藥物:加味四逆散:柴胡、枳殼、桃仁各10g,白芍20g,姜黃30g,丹參25g,黃芪40g。以上藥物均購自陜西中醫(yī)學院附屬醫(yī)院中藥房,藥物經(jīng)加水浸泡,常規(guī)煎煮,過濾,水浴蒸發(fā)至3.12g/mL濃度的藥液;復(fù)方鱉甲軟肝片:0.5g/片,批號:20100808,用蒸餾水溶解至0.625g/mL。

        1.1.3 動物細胞:HSC-T6(大鼠肝星狀細胞):購自上??蠌妰x器有限公司,編號zy1002。

        1.1.4 主要試劑:RPMI-1640干粉培養(yǎng)基(美國Gibco公司,按每10.4g 1640干粉培養(yǎng)基溶于900mL雙蒸水,待其分溶解,加入青霉素100U/mL,硫酸鏈霉素I00U/mL,用1mol/L NaOH調(diào)節(jié)PH至7.1~7.4,定容至1000mL,采用0.22μm微孔濾膜過濾除菌,分裝后于4℃冰箱保存);胰蛋白酶(美國Sigma,進口分裝,濃度為1:250,即0.25%,用胰蛋白酶0.25g,PBS100mL,充分溶解,0.22μm微孔濾膜過濾除菌,分裝后于4℃冰箱保存。臨用時用無菌的7.4%NaHCO3調(diào)節(jié)PH至7.2左右);胎牛血清(FBS,鄭州益康生物工程有限公司);二甲基亞楓(DMSO,美國Sigma公司);四甲基偶氮唑藍(MTT,美國Sigma公司)

        1.1.5 主要儀器:二氧化碳培養(yǎng)箱(德國Bind CB-150);電子精密天平(BS124S型,北京賽多科斯儀器系統(tǒng)有限公司);超低溫冰箱(美國熱電702型);全自動酶標儀(美國Bio-Tek ELX808IU)。

        1.2 實驗方法 1.2.1 分組:將30只實驗大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機分為5組:空白對照組;加味四逆散低濃度組;加味四逆散中濃度組;加味四逆散高濃度組;復(fù)方鱉甲軟肝片組,每組均6只。

        1.2.2 制備含藥血清:空白對照組每只按1mL/100g給予生理鹽水灌胃,1次/d;加味四逆散低濃度組每只按1mL/100g(每毫升含生藥量0.78g)灌胃,1次/d;加味四逆散中濃度組每只按1mL/100g(每毫升含生藥量1.56g)灌胃,1次/d;加味四逆散高濃度組每只按1mL/100g(每毫升含生藥量3.12g)灌胃,1次/d;復(fù)方鱉甲軟肝片組每只按1mL/100g(每毫升含生藥量0.625g)灌胃,1次/d;以上各組大鼠均連續(xù)灌胃7d。最后一次灌藥(灌藥前禁食不禁水12h)1h后,每只大鼠按0.35mL/100g給予10%水合氯醛進行麻醉,腹主動脈采血,離心分離血清,56℃水浴中滅活30min,0.45um微孔濾膜過濾,-20℃冷藏備用。

        1.2.3 細胞培養(yǎng)及傳代:HSC-T6以含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)于含5%CO2、飽和濕度為37℃環(huán)境中。RPMI-1640中含100U/mL青霉素、100U/mL硫酸鏈霉素,每2d傳代1次。培養(yǎng)方法:本實驗的HSC-T6是原代細胞,將HSCT6細胞于37℃快速復(fù)蘇,常規(guī)0.4%臺昐藍拒染法進行細胞活力鑒定,細胞計數(shù)調(diào)節(jié)成(0.5~1)×105/L的濃度并接種在100mL培養(yǎng)瓶中,于5%CO2、飽和濕度的二氧化碳培養(yǎng)箱里培養(yǎng)1~3d,當細胞完全貼壁后換液,以后每3~4d換1次培養(yǎng)液。每隔4~8h用顯微鏡觀察細胞形態(tài)及生長狀態(tài)。

        當細胞生長至80%左右匯合后傳代,吸取全部細胞培養(yǎng)液,PBS洗1~2次,滴加37℃預(yù)熱的0.25%胰蛋白酶1~2mL,以液面覆蓋細胞為宜。轉(zhuǎn)動培養(yǎng)瓶,使胰酶鋪滿培養(yǎng)瓶底,顯微鏡下觀察胞質(zhì)回縮,胞間間隙增大時快速吸取胰酶,滴加5mL培養(yǎng)液,終止消化,反復(fù)輕柔吹打10~15次,使成單細胞懸液,以1∶2或1∶3稀釋后傳代,培養(yǎng)24h換液,48h再次傳代。

        1.2.4 MTT比色法檢測藥物對HSC-T6增殖的影響:取對數(shù)生長期HSC-T6,調(diào)節(jié)細胞濃度為2×104個細胞/mL,將調(diào)整濃度后的細胞接種于96孔培養(yǎng)板,培養(yǎng)12h;細胞貼壁后,吸棄原培養(yǎng)液,分組加入藥物血清??瞻讓φ战M加入生理鹽水大鼠血清0.5mL;加味四逆散低濃度組、加味四逆散中等濃度組、高濃度組分別加入不同濃度加味四逆散大鼠藥物血清0.5mL;復(fù)方鱉甲軟肝片組加入鱉甲軟肝片大鼠藥物血清0.5 mL;以上各組每組設(shè)6個復(fù)孔,處理12h、24h、48h。每孔加入5mg/mL的MTT液20μL,37℃繼續(xù)培養(yǎng)4h后,小心吸出上清液,每孔加入DMSO150μL混均,震蕩10min使紫藍色沉淀充分溶解,用酶標儀(ELX808IU型)在490nm波長檢測各孔吸光度值(OD值)。以上實驗重復(fù)3次,求平均值;抑制率=(1-實驗組平均OD值/對照組平均OD值)×100%,計算抑制率。

        1.2.5 統(tǒng)計學方法:采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件,計量資料以均數(shù)±標準差表示,多個樣本的比較采用單因素方差分析,多個樣本的兩組間比較采用SNK-q檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

        2 實驗結(jié)果 不同濃度加味四逆散藥物血清作用生長良好的肝星狀細胞12h、24h、48h后,MTT比色法顯示隨加味四逆散含藥血清濃度的增加,HSC490nm波長處吸光度值(OD值)逐漸降低,抑制率上升,呈現(xiàn)量效與時效關(guān)系。藥物組細胞抑制率明顯高于空白對照組(P<0.01);加味四逆散低、中、高濃度組與鱉甲軟肝片組相比較,除低、中濃度組作用12h、24h時無差異(P>0.05)外,其余濃度組均優(yōu)于鱉甲軟肝片組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。細胞490nm波長處吸光度值與加味四逆散作用時間和濃度的關(guān)系,見表1。

        表1 不同濃度加味四逆散藥物血清對HSC增殖的影響()

        表1 不同濃度加味四逆散藥物血清對HSC增殖的影響()

        注:與空白對照組比較,△P<0.01;與鱉甲軟肝片組比較,▲P<0.05,◇P>0.05

        3 討 論 不同病因?qū)е赂卫w維化的共同途徑是肝星狀細胞(HSC)的激活,HSC轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞,合成大量的細胞外基質(zhì)(ECM),ECM在肝內(nèi)大量沉積,導(dǎo)致肝纖維化形成。有報道人HSC活化增殖時Ⅰ型膠原mRNA為靜止時的60~70倍[6],故 HSC活化增殖是肝纖維化發(fā)生的細胞學基礎(chǔ)[7],HSC活化增值是肝纖維化形成的中心環(huán)節(jié)。體外培養(yǎng)的HSC可自發(fā)活化,目前是體外研究藥物抗肝纖維化較為理想的模型。我們此次以HSC為靶點,用中藥復(fù)方加味四逆散藥物血清為干預(yù)因素,研究該藥對肝星狀細胞增殖的影響。

        復(fù)方鱉甲軟肝片在臨床上用于治療HF已經(jīng)得到公認,并且體外研究已明確其對肝纖維化早期有明顯阻斷作用,并可抑制HSC活化、增殖及ECM的形成,從而阻止慢性肝病肝纖維化的發(fā)生和進展[8]。因此我們選用復(fù)方鱉甲軟肝片作為陽性對照組。

        本研究用MTT檢測法觀察加味四逆散含藥血清對HSC增殖的影響,吸光度值能間接反映活細胞的數(shù)量,結(jié)果表明加味四逆散含藥血清能顯著抑制HSC增殖,隨作用濃度的增加和作用時間的延長,490nm波長處吸光度值逐漸降低,抑制率上升,呈現(xiàn)量效和時效關(guān)系。實驗組細胞抑制率明顯高于空白對照組(P<0.01);加味四逆散低、中、高濃度組與鱉甲軟肝片組比較,除低、中濃度組作用12h、24h時無差異(P>0.05)外,其余濃度組均優(yōu)于鱉甲軟肝片組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。本研究結(jié)果提示加味四逆散可以抑制HSC增殖,這可能是其抗肝纖維化的途徑之一。

        [1]李長秦,胡建軍,鄭旭銳,等.加味四逆散對肝纖維化大鼠肝組織ⅠⅢ型膠原含量的影響[J].陜西中醫(yī),2004,25(9):852-854.

        [2]李長秦,鄭旭銳 孫守才,等.加味四逆散肝纖維化大鼠肝組織Ⅳ型膠原和轉(zhuǎn)化生長因子β1影響的免疫組化研究[J].云南中醫(yī)學院學報,2004,27(3):25-27.

        [3]鄭旭銳,孫守才,李長秦.加味四逆散治療肝纖維化量效關(guān)系實驗研究[J].吉林中醫(yī)藥,2008,28(5):25-27.

        [4]鄭旭銳,孫守才,韋永紅,等.加味四逆散對肝纖維化大鼠肝組織Ⅰ,Ⅲ型膠原mRNA影響的研究[J].時珍國醫(yī)國藥,2007,18(8):1923-1924.

        [5]鄭旭銳,孫守才,李長秦,等.加味四逆散對肝纖維化大鼠肝組織TGFβ1、CTGFmRNA影響的研究[J].時珍國醫(yī)國藥,2009,20(10):2597-2598.

        [6]董培紅,何生松,蘇 剛,等.內(nèi)毒素對大鼠肝星狀細胞活化和瘦素表達的影響[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志,2006,15(2):156-158.

        [7]Iredale JP,Benyon RC,Pickering J,et al.Mechanisms of spontaneous resol-Ution of rat liver fibrosis.Hepatic stellate cell apoptosis and reduced hepaticexpression of metalloproteinase inhibitors.J Clin Ivest,1998,102:538-549.

        [8]趙景明,周光德,李文淑,等.復(fù)方鱉甲軟肝片抗肝纖維化機制的實驗研究[J].解放軍醫(yī)學雜志,2004,29(7):560-562.

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