張占軍，王富花，曾曉雄

（1.揚州環(huán)境資源職業(yè)技術學院，江蘇揚州 225127；2.南京農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，江蘇南京 210095；3.揚州工業(yè)職業(yè)技術學院，江蘇揚州 225127）

多糖廣泛存在于植物、微生物（真菌和細菌）、藻類和動物體。目前多糖已成為天然藥物及保健品研發(fā)中的重要組成部分，國外多數(shù)制藥公司都有從事糖類藥物的研發(fā)。研究發(fā)現(xiàn)多糖具有抗氧化，抗腫瘤，抗凝血及免疫調節(jié)等多種功能。我國也十分重視多糖和糖復合物的研究工作，如國家基金委2011項目指南將扶持和鼓勵多糖和糖復合物的研究列入生命科學重點資助方向。薤白（Allium macrostemonBunge）為衛(wèi)生部2002年公布的87種藥食兩用植物之一，薤白別名野蔥、野白頭、小根蒜等，為百合科蔥屬多年生草本植物，廣泛分布于中國、日本和韓國等國的平原地區(qū)，多食用，其干燥鱗莖也可入藥，藥用薤白為植物小根蒜A.macrostemonBge.或薤Allium chinensisG.Don的干燥鱗莖[1]。薤白味辛、苦，性溫，無毒，具有理氣、寬胸、通陽、散結之功效，中醫(yī)長期用于治療胸悶刺痛、瀉痢后重、肺氣喘急等疾病[2]。目前有關薤白多糖的研究主要集中在國內(nèi)，夏新奎等[3-6]對薤白多糖進行了分離純化及體外抗氧化活性研究，結果發(fā)現(xiàn)其中堿洗級分具有較高的清除OH·作用。另外杜敏華等[7-8]對新鮮小根蒜多糖進行了提取純化及對單糖組分進行了鑒定，確定了其單糖組分主要為果糖和葡萄糖。除此以外有關薤白多糖的研究未見任何文獻報道。本工作擬利用分步醇沉法，通過提取分離純化得到低分子量的薤白多糖，應用苯酚-硫酸法、考馬斯亮藍法、硫酸-間羥聯(lián)苯法、氯化鋇-明膠法、高效液相凝膠滲透色譜法、紅外及紫外光譜法對其理化性質進行研究，并對其抑制腫瘤細胞BGC-823的增殖活性進行研究，有望為薤白的臨床使用及保健性食品的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

薤白：安徽慧隆中藥飲片有限公司提供，產(chǎn)地江蘇，經(jīng)南京農(nóng)業(yè)大學園藝學院郭巧生教授鑒定為百合科蔥屬植物薤白Allium macrostemonBge.的干燥鱗莖；DEAE-纖維素-52凝膠與Sephadex G-100、噻唑藍（MTT）：Sigma公司。

1.2 儀器與設備

HP 1100高效液相色譜系統(tǒng)、6890N氣相色譜儀：美國Agilent公司；IR 200傅里葉紅外光譜儀：美國Nicolet公司；Alpha 1-2型冷凍干燥機：英國LABCONCO公司。

1.3 方法

1.3.1 薤白多糖的分步醇沉

取薤白鱗莖189.0 g，經(jīng)烘箱80℃烘干，粉碎后過篩（孔篩0.5 mm），置圓底燒瓶中，同時加入3倍量石油醚電熱套加熱回流脫脂3 h，55℃烘干后用80%（體積百分比濃度，下同）乙醇回流3 h，以除去部分色素及低聚糖，揮干乙醇后粉碎，得經(jīng)預處理的薤白粉末149.6 g；按照已得出的優(yōu)化條件，在經(jīng)預處理的薤白粉末中加入12倍體積蒸餾水，87℃浸提100 min，重復提取3次，合并提取液并濃縮，濃縮液加乙醇至終濃度為40%，5 000 r/min離心10 min，凍干得粗多糖AMP40及上清液；將以上上清液濃縮至無醇后，加乙醇至終濃度為60%，離心凍干得粗多糖AMP60及上清液；將該上清液濃縮至無醇后，加乙醇至乙醇終濃度為80%，離心棄去上清液，凍干得粗多糖AMP80。

1.3.2 薤白粗多糖AMP80的分離純化

1.3.2.1 薤白多糖的DEAE-52纖維素柱色譜

按照Qiao等[9]報道的方法稍作修改，即采用DEAE-52-纖維素交換柱色譜法對薤白粗多糖進行初步分離純化，即將經(jīng)預處理的DEAE-纖維素濕法裝柱（2.6×30 cm），柱子裝好后依次用3倍柱體積的蒸餾水、2倍柱體積0.5 mol/L的NaCl和2倍柱體積的蒸餾水進行平衡，備用。將薤白多糖AMP80樣品裝入透析袋，蒸餾水透析48 h后凍干得AMP80T。取AMP80T約200 mg用蒸餾水溶解后上樣，分別用蒸餾水，0.1、0.3、0.5 mol/L的NaCl進行洗脫，流速1.0 mL/min，分步收集流分，根據(jù)苯酚-硫酸法顯色反應結果合并相同餾分。各級分濃縮，裝入透析袋，蒸餾水透析48 h，冷凍干燥即可得多糖DEAE-52純化產(chǎn)物。同時以收集的管數(shù)為橫坐標、吸光值為縱坐標繪制DEAE-52-纖維素色譜柱洗脫曲線。

1.3.2.2 薤白多糖的葡聚糖凝膠色譜法純化

經(jīng)DEAE-52纖維素初步純化的多糖樣品用葡聚糖凝膠Sephadex色譜柱法進行進一步純化，分別稱取經(jīng)DEAE-52纖維素初步純化的各多糖組分約20 mg，溶于2 mL去離子水中（如不溶，可適當加熱），濕法上樣于Sephadex G-100層析柱（2.6×60 cm）。用去離子水洗脫，流速0.50 mL/min，分步收集器收集（10 min/管）。硫酸-苯酚法檢測各收集管中多糖含量（490 nm處吸收值），同時以收集的管數(shù)為橫坐標、吸光值為縱坐標繪制葡聚糖Sephadex G-100色譜柱洗脫曲線。

1.3.3 薤白多糖的基本理化性質分析

1.3.3.1 總糖含量測定

采用苯酚-硫酸法[10]測定總糖含量。

1.3.3.2 蛋白質含量測定

多糖樣品中蛋白質含量的測定，采用Bradford[11]報道的考馬斯亮藍法并略作修改。即配制適當濃度的樣品溶液，準確吸取1.0 mL，加考馬斯亮藍G-250液5.0 mL，混勻，2 min后測595 nm波長的吸光值。該法靈敏度高、操作簡便，是一種常用的微量蛋白質快速測定方法。

1.3.3.3 糖醛酸含量測定

多糖樣品中糖醛酸含量的測定，采用Blumenkrantz等[12]報道的硫酸-間羥聯(lián)苯法略作修改。即取多糖溶液0.25 mL，冰浴中冷卻后各管加上述四硼酸鈉-濃硫酸溶液1.5 mL，旋渦混合器混勻，沸水浴中加熱5 min，冰浴冷卻至室溫。各管再加0.15%間羥聯(lián)苯溶液0.025 mL，混勻，于分光光度計520 nm處測吸光值。根據(jù)葡萄糖醛酸標準曲線和多糖樣品的吸光值計算出多糖樣品中糖醛酸含量。

1.3.3.4 硫酸基含量測定

多糖樣品中硫酸基含量的測定，參照Dodgson等[13]報道的氯化鋇－明膠比色法并略作修改。即稱取多糖樣品約10 mg，加1 mL鹽酸溶液（1 mol/L），密封試管，于恒溫干燥箱中100℃水解6 h。冷卻后，旋轉蒸發(fā)器40℃旋轉蒸干，殘渣用1 mL蒸餾水溶解。取水解液0.2mL，加蒸餾水0.8mL，再加8%三氯乙酸溶液0.7 mL、0.5%氯化鋇明膠溶液0.5 mL，混勻，冷卻，15 min后測360 nm波長的吸光值（A1）。另取一份水解液0.2 mL，加蒸餾水0.8 mL，再加8%三氯乙酸溶液0.7 mL、0.5%明膠溶液0.5 mL，混勻，冷卻，15 min后測360 nm波長的吸光值（A2）。用以消除水解液中所含紫外物質的干擾。根據(jù)硫酸鉀標準曲線和兩次反應體系的吸光值之差（A1－A2）計算多糖樣品中硫酸基的含量。

1.3.3.5 純度鑒定及相對分子質量測定

多糖樣品的純度鑒定和相對分子質量測定，參照Alsop等[14]以及Roy等[15]報道的高效液相凝膠滲透色譜法（HPGPC）稍作修改。

1）色譜條件

Agilent 1100 series高效液相色譜及示差檢測器；TSK－Gel G3000 SWxl色譜柱 （7.5×300 mm，Tosoh Corp.，Tokyo，Japan）；流動相：含 0.1 mol/L Na2SO4的0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液（pH6.8）；流速：0.70 mL/min；進樣量：20 μL；柱溫：25 °C。

2）分子量－保留時間標準曲線的繪制

精確稱取不同分子量普魯蘭多糖P－82系列的標準樣品（0.59～78.8×104u），用流動相配制成濃度約為1.5 mg/mL的分子量標準樣品溶液，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后，按以上色譜條件依次進樣，記錄相應的保留時間（retention time，tR），然后以分子量對數(shù)（logMw）為縱坐標，保留時間為橫坐標繪制標準曲線，回歸得出相應線性方程。

3）多糖分子量測定

將待測多糖同法配制成濃度為1.5 mg/mL的溶液，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，在相同條件下進行高效液相色譜分析，獲得各多糖HPGPC圖譜，并記錄樣品色譜圖的保留時間tR值。根據(jù)多糖分子量標準曲線和多糖樣品在色譜圖上的保留時間可計算出多糖樣品的重均相對分子量；同時分析多糖樣品色譜圖上的色譜峰數(shù)目和形狀進一步鑒定多糖的純度。

1.3.3.6 紅外光譜分析

多糖樣品的紅外光譜分析參照Wang等[16]報道的KBr壓片法，在傅立葉紅外光譜儀Nicolet IR 200（Madison，WI，USA）上進行。稱取2 mg左右經(jīng)P2O5干燥的多糖樣品，與已干燥的適量KBr粉末在瑪瑙研缽中充分研磨均勻，用壓片機壓成薄片，進行紅外光譜測定，掃描范圍為 4 000 cm－1～ 500 cm－1。測定樣品前用不加多糖樣品的KBr薄片進行背景基線掃描。

1.3.3.7 紫外光譜掃描

稱取多糖樣品，用去離子水配成2 mg/mL的溶液，用UNICO UV－2802型紫外可見分光光度計進行掃描，掃描波長190 nm～800 nm。

1.3.4 薤白多糖樣品對BGC－823細胞增殖的抑制作用

以薤白多糖純化組分AMP80－1為實驗樣品，對接種BGC－823的細胞培養(yǎng)板預培養(yǎng)24 h后進行加樣處理，用排槍每孔吸去50 μL培養(yǎng)液。實驗設正常對照組和不同濃度（25、50、100、200、400 μg/mL）的樣品組。正常對照組每孔加50 μL DMEM培養(yǎng)液；樣品組分別加入終濃度為 25、50、100、200、400 μg/ml的 AMP80－1溶液（用新鮮DMEM完全培養(yǎng)基溶解）各50 μL/孔。人胃癌細胞 BGC－823分別培養(yǎng) 24、48、72 h后，加入5 mg/mL MTT溶液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，小心移去培養(yǎng)液，每孔加入100 μL DMSO溶液溶解藍紫色結晶。水平晃動搖勻后，用酶標儀測定550 nm波長下各孔的光吸收值（Abs），檢測不同多糖樣品對腫瘤細胞的抑制情況，按下式計算多糖對腫瘤細胞的抑制率：

抑制率/%=（1－Abs樣品/Abs對照）×100。

2結果與分析

2.1 薤白多糖的分步醇沉

薤白鱗莖經(jīng)干燥、粉碎、熱水提取、乙醇分步沉淀、離心，凍干，分別得到不同級分的薤白粗多糖提取物。其中80%醇沉部分（AMP80）18.5 g，得多糖粗提物AMP80的提取率為9.8%。

2.2 薤白多糖的DEAE－纖維素－52色譜法初步分離

將AMP80溶于適量蒸餾水中，加樣進行DEAE－52纖維素柱層析，流速1 mL/min，自動收集器分部收集，每隔10 min收集1管，苯酚－硫酸法跟蹤檢測各管糖含量，繪制洗脫曲線，如圖1所示。

2.3 初步純化組分經(jīng)Sephadex G－100的進一步純化

對經(jīng)DEAE－52纖維素色譜柱初步純化的組分F，通過葡聚糖凝膠Sephadex G－100柱層析對其分別進行進一步純化得純化多糖AMP80－1，具體洗脫曲線如圖2所示。

2.4 薤白多糖的基本理化性質

薤白粗多糖AMP80及其純化組分AMP80－1的總糖、蛋白質、糖醛酸及硫酸基含量見表1。

表1 薤白多糖AMP80及AMP80-1的基本理化性質Table 1 Preliminary characterization of AMP80 and AMP80-1

從表1可以看出，薤白多糖AMP80經(jīng)純化后，總糖含量，硫酸基含量均有上升，而糖醛酸含量有所降低，AMP80及AMP80－1均不含蛋白質。

2.5 純度及相對分子質量

采用高效液相凝膠滲透色譜法對薤白多糖純化組分AMP80－1的分子量進行了測定，同時進一步對純化多糖的均一性進行了驗證結果見圖3。

從圖3可以看出，多糖組分AMP80－1在色譜柱上顯示峰形為對稱的單峰（由于色譜柱流速原因，存在一定的拖尾現(xiàn)象）。其保留時間分別為15.084 min。利用在一定范圍內(nèi)，多糖保留時間與其相對分子質量的對數(shù)呈線性關系，以已知分子量的普魯蘭多糖為標準品，通過高效液相凝膠滲透色譜法繪制相對分子量的標準曲線，得回歸方程為：LogMw=－4.275 3x+31.807，R2=0.998 9，運用線性回歸方程計算，得到AMP80－1的重均相對分子質量是8.1 ku。

2.6 薤白多糖的紅外光譜分析

采用KBr壓片法，借助于Nicolet IR 200紅外光譜儀對薤白粗多糖AMP80及其純化組分AMP80－1進行紅外光譜分析，其結果如圖4所示。

從圖 4 可以看出，在 3 500 cm－1～3 300 cm－1范圍內(nèi)出現(xiàn)了寬而強的多糖羥基O－H伸縮振動峰，其值小于 3 400 cm－1，說明為分子間氫鍵，3 000 cm－1～2 800 cm－1范圍內(nèi)出現(xiàn)多糖的C－H強伸縮振動峰，這兩個吸收峰均為多糖類物質的特征峰[17]。其中AMP80－1在931cm－1處和1 024 cm－1處出現(xiàn)吸收峰，這是由吡喃環(huán)的環(huán)非對稱環(huán)伸縮振動和吡喃糖環(huán)的C－O伸縮振動造成的[18]。由此可以推斷，薤白多糖AMP80－1主要為吡喃環(huán)糖苷連接。

2.7 薤白多糖的紫外光譜分析

采用紫外可見分光光度法對薤白純化多糖AMP80-1進行了紫外光譜掃描，結果如圖5所示。

可以看出：薤白純化多糖AMP80-1在260 nm和280 nm處均沒有吸收峰，表明其不含有核酸和蛋白質，此結果與薤白多糖樣品中未檢出蛋白質的測定結果一致。這也進一步說明AMP80-1為單純的多糖組分。

2.8 薤白多糖AMP80-1對人肺癌細胞BGC-823生長的抑制作用

薤白多糖純化組分AMP80-1對人胃癌細胞BGC-823作用24、48、72 h后增殖的影響如圖6所示。

從圖6可以看出，在同一濃度下，隨著作用時間的延長，薤白多糖AMP80-1對人胃癌細胞BGC-823生長的抑制作用逐漸增強。作用24 h時，抑制作用較弱，濃度差別不明顯；作用48 h時，呈較明顯的濃度梯度效應，即隨著濃度的增加抑制作用也逐漸增強；作用72 h時，剛開始也呈現(xiàn)呈較明顯的濃度梯度效應，但當多糖濃度達到400 μg/mL時，抑制作用有所下降。

3 結論

本文對薤白鱗莖經(jīng)干燥、粉碎、熱水提取、40%，60%和80%乙醇分步沉淀、離心，凍干，得到不同80%醇沉級分AMP80，其提取率為9.8%。經(jīng)DEAE-52纖維素柱層析及葡聚糖凝膠Sephadex G-100柱層析純化后得到薤白純化多糖AMP80-1，分別采用苯酚-硫酸法、考馬斯亮藍法、硫酸-間羥聯(lián)苯法、氯化鋇-明膠法對薤白粗多糖AMP80及純化組分AMP80-1中總糖、蛋白質、糖醛酸、硫酸基含量進行了分析。結果表明，各多糖組分不含蛋白質，硫酸基含量普遍較低。采用高效液相凝膠滲透色譜法對AMP80-1的均一性進行了鑒定，同時測定了其相對分子質量為8.1 ku。紅外光譜分析結果表明：AMP80-1主要為吡喃糖苷連接，紫外光譜分析結果表明，AMP80-1在260 nm和280 nm處均未出現(xiàn)明顯的吸收峰，說明其不含核酸和蛋白質，這一結果與理化分析中蛋白質含量的測定結果一致。細胞實驗結果顯示，薤白多糖AMP80-1對人胃癌細胞BGC-823生長存在一定的抑制作用，但抑制作用相對較弱，其對人胃癌細胞的抑制作用強弱是否與其較低的糖醛酸、硫酸基含量及低分子量有關，還需做進一步的研究。

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