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        酸菜乳酸菌分離鑒定及共軛亞油酸含量分析

        2012-09-05 14:21:36劉海霞鄭婷趙國芬包秋華張和平
        食品研究與開發(fā) 2012年12期
        關(guān)鍵詞:亞油酸酸菜共軛

        劉海霞,鄭婷,趙國芬,*,包秋華,張和平

        (1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,內(nèi)蒙古呼和浩特010018;

        2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院,內(nèi)蒙古呼和浩特 010018)

        近年來,共軛亞油酸由于其重要的生理功能受到人們的重視[1],乳酸菌微生物合成共軛亞油酸是一種經(jīng)濟高效的途徑[2],而酸菜是世界性大眾化蔬菜腌制品,在我國歷史悠久[3],其自然發(fā)酵的主要菌群是乳酸菌[4]。本實驗從自然發(fā)酵的酸菜汁分離鑒定乳酸菌并用紫外法測定共軛亞油酸含量,并得到一株高產(chǎn)共軛亞油酸的菌株,為酸菜制品研究和共軛亞油酸工業(yè)化生產(chǎn)提供理論和實驗參考。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        自然發(fā)酵的酸菜汁;牛肉膏、蛋白胨:廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;磷酸氫二鉀:北京益利粗細(xì)化學(xué)品有限公司;無水乙酸鈉:天津市永大化學(xué)試劑開發(fā)中心;檸檬酸銨:天津市凱通化學(xué)試劑有限公司;硫酸鎂、硫酸錳:天津市科盟化工工貿(mào)有限公司;吐溫80:廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;溴甲基酚紫培養(yǎng)基:上海博微生物科技有限公司;瓊脂、亞油酸:美國sigma公司。

        1.2 實驗主要設(shè)備

        PYX-DHS電熱恒溫培養(yǎng)箱:上海一恒科技有限公司;SW-CJ-1FD超凈工作臺:蘇州安泰空氣技術(shù)公司;LS-B50L高壓蒸汽殺菌鍋:上海醫(yī)用核子廠;UV-1800PC紫外分光光度:計北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;GS00001PCR 儀:Gene Technologies,Geldoc 2000凝膠成像系統(tǒng):Bio-Rad Laboratories,核酸電泳儀:Power pac Bio-Rad Laboratories。

        1.3 方法

        1.3.1 乳酸菌的分離純化

        酸菜汁用無菌水梯度稀釋,稀釋度分別為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5,各取 200 μL 倒入含溴甲基酚紫的平板培養(yǎng)皿中,用涂布棒將其涂勻,涂干;涂菌后放入37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。從培養(yǎng)基長勢較好,菌落易分辨的培養(yǎng)基平板上挑起單菌落進行革蘭氏染色、顯微鏡鏡觀察形態(tài)[5]。將革蘭氏陽性菌涂在MRS固體培養(yǎng)基中(涂Z型),隨后放入37℃培養(yǎng)箱,培養(yǎng)48 h。挑選大的球菌反復(fù)在MRS固體培養(yǎng)基上幾次純化篩選。進行3次后,菌落基本純化。將純化的菌接到MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng),進行擴大培養(yǎng)[6]。培養(yǎng)48 h進行DNA提取和16S rDNA鑒定。并取適量菌種加甘油于-70℃?zhèn)溆谩?/p>

        1.3.2 乳酸菌的鑒定

        1.3.2.1 乳酸菌形態(tài)的觀察

        乳酸菌屬在MRS培養(yǎng)基上的菌落大致呈現(xiàn)乳白色,濕潤,桿菌邊緣不整齊,球菌邊緣整齊,直徑在1 mm~3 mm左右。乳酸菌為一類革蘭氏陽性球菌或桿菌[7]。

        1.3.2.2 16 S rDNA菌種鑒定[8]

        1)引物設(shè)計

        根據(jù)細(xì)菌16 S rDNA一端長為1 225 bp保守序列,設(shè)計一對細(xì)菌的通用引物,用于PCR擴增,引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。引物序列如下:

        引物 1:5′-CCG GAT CCAGAG TTT GAT CAT GGC TCAGCA-3′

        引 物 2:5′-CGG GAT CCTACG GCTACC TTG TTACGACTT-3′

        2)乳酸菌DNA的提取

        參照細(xì)菌提取方法提取乳酸菌DNA[9]。

        3)PCR反應(yīng)體系

        按表1將下列成分加入PCR管中。

        4)PCR擴增程序

        按表2進行16 SrDNA PCR擴增。

        5)PCR產(chǎn)物的克隆

        將PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳后,用膠回收試劑盒回收特異性目的片段。將回收的PCR產(chǎn)物與pMD19-T載體進行連接,反應(yīng)采用10 μL反應(yīng)體系,即:加入 pMD19-T 載體 0.5 μL,PCR 產(chǎn)物 5.0 μL,Ligation solution 4.5 μL,16℃連接過夜。用連接的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,涂布含有AMP的培養(yǎng)基平板,37℃培養(yǎng)12 h~16 h后,挑取白色菌落,進行PCR鑒定。

        表116 SrDNA PCR MixTable 1 16S rDNA PCR Mix

        表2 16 S rDNA PCR程序Table 2 Procedure of 16 S rDNA PCR

        6)16 SrDNA的序列測定及與標(biāo)準(zhǔn)序列的比較

        將經(jīng)過鑒定的含重組質(zhì)粒的菌種送華大基因公司進行序列測定。序列測定結(jié)果通過Internet網(wǎng)(http://www.ncbi.nlm.nih gov/blast.cgi), 將 所 測 序 列 與Genbank數(shù)據(jù)庫中已報到的序列進行相似性比較。

        1.4 產(chǎn)生共軛亞油酸能力的測定

        共軛亞油酸在233 nm處有最大吸收峰。用色譜純的正已烷為溶劑,將CLA標(biāo)樣稀釋成不同濃度的溶液,以正已烷為參照,在紫外233 nm處測定CLA(共軛亞油酸)標(biāo)樣溶液的吸光值,以CLA濃度為橫坐標(biāo),吸光值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。線性回歸方程為y=0.094 6x-0.004 8[10]。

        取0.2 mL活化好的菌液,接菌于裝有10 mL篩選培養(yǎng)基的試管中,37℃靜置培養(yǎng)36 h。發(fā)酵結(jié)束后,置于50 mL三角瓶中,加入25 mL正己烷,210 r/min萃取1 h,10 000 r/min離心20 min,以未接種的篩選培養(yǎng)基為參照,取正己烷層,233 nm處測定吸光值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出共軛亞油酸的生成量[11]。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 酸菜汁中乳酸菌的篩選結(jié)果

        2.1.1 溴甲基酚紫培養(yǎng)基培養(yǎng)

        通過培溴甲基酚紫培養(yǎng)基初步篩選發(fā)現(xiàn),10-5稀釋度試管中的菌長勢最好,生長情況如圖1。說明有產(chǎn)酸的細(xì)菌產(chǎn)生。

        2.1.2 革蘭氏染色、電鏡觀察

        將上述產(chǎn)酸的細(xì)菌進行電鏡觀察,為革蘭氏陽性桿菌,圖2和圖3的菌分別命名為L菌和S菌,均為為短棒狀。

        2.1.3 MRS固體培養(yǎng)基培養(yǎng)

        純化后的L菌落和純化后的S菌落,見圖4,圖5。

        2.2 16 S rDNA鑒定結(jié)果2.2.1 DNA的電泳結(jié)果

        對篩選出的L菌和S菌提取DNA電泳檢測結(jié)果如圖6,圖6表明L、S菌的DNA提取成功。

        2.2.2 PCR的電泳結(jié)果

        以篩選出L、S菌基因組DNA為模板,以特異性引物擴增16 S rDNA片段,結(jié)果如圖7。從圖7可以看出各菌均擴增出約1 300 bp片段,大小與預(yù)期的16Sr-DNA片段一致。

        2.2.3 菌落PCR鑒定

        菌落PCR電泳圖,見圖8。

        菌落PCR結(jié)果如圖8所示,兩個菌株均得到了1.3 kb左右大小的片段,均為陽性克隆,與預(yù)期相符,表明兩株菌株的16 S rDNA均與pMD19-T載體連接成功。

        2.2.4 菌株16SrDNA序列測定結(jié)果與比對

        將擴增出L、S菌的16 S rDNA片段,送華大基因測序,序列結(jié)果如下:

        表3 各菌測序比對結(jié)果Table 3 The sequencing alignment results of the strains

        從表3可以看出L、S菌與棒狀乳桿菌的同源性均在99%,初步判斷L、S菌均為棒狀乳桿菌。

        2.3 亞油酸異構(gòu)酶酶活測定結(jié)果

        發(fā)酵檢測L和S菌株的CLA濃度分別為0.004 4 mg/mL和0.010 7 mg/mL,CLA的轉(zhuǎn)化率分別是1.03%和2.51%。

        3 結(jié)論

        從自然發(fā)酵酸菜汁中用含溴甲基酚紫培養(yǎng)基只分離出兩株乳酸菌,說明這兩株菌為釀制酸菜過程中的優(yōu)勢菌株。該菌株經(jīng)過革蘭氏染色、電鏡觀察和16 S rDNA菌種鑒定為棒狀乳桿菌(Lactobacillus coryniformis subsp.torquens strain30),經(jīng)測定L和S菌株產(chǎn)CLA分別為0.004 4 mg/mL和0.010 7 mg/mL,CLA轉(zhuǎn)化率分別為1.03%和2.51%;S菌共軛亞油酸的能力較高,在以后的研究中對所選取的反應(yīng)條件和時間進行改進和優(yōu)化,以進一步提高底物的轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物得率,為食品、醫(yī)藥、工業(yè)上的進一步應(yīng)用提供參考。

        [1]王月囡,曹鍵,曾實,等.共軛亞油酸生物合成的研究[J].食品研究與發(fā),2006,27(4):4-8

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