劉海霞，鄭婷，趙國芬，*，包秋華，張和平

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特010018；

2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018）

近年來，共軛亞油酸由于其重要的生理功能受到人們的重視[1]，乳酸菌微生物合成共軛亞油酸是一種經(jīng)濟高效的途徑[2]，而酸菜是世界性大眾化蔬菜腌制品，在我國歷史悠久[3]，其自然發(fā)酵的主要菌群是乳酸菌[4]。本實驗從自然發(fā)酵的酸菜汁分離鑒定乳酸菌并用紫外法測定共軛亞油酸含量，并得到一株高產(chǎn)共軛亞油酸的菌株，為酸菜制品研究和共軛亞油酸工業(yè)化生產(chǎn)提供理論和實驗參考。

1 材料與方法

1.1 材料

自然發(fā)酵的酸菜汁；牛肉膏、蛋白胨：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；磷酸氫二鉀：北京益利粗細(xì)化學(xué)品有限公司；無水乙酸鈉：天津市永大化學(xué)試劑開發(fā)中心；檸檬酸銨：天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；硫酸鎂、硫酸錳：天津市科盟化工工貿(mào)有限公司；吐溫80：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；溴甲基酚紫培養(yǎng)基：上海博微生物科技有限公司；瓊脂、亞油酸：美國sigma公司。

1.2 實驗主要設(shè)備

PYX-DHS電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司；SW-CJ-1FD超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術(shù)公司；LS-B50L高壓蒸汽殺菌鍋：上海醫(yī)用核子廠；UV-1800PC紫外分光光度：計北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；GS00001PCR 儀：Gene Technologies，Geldoc 2000凝膠成像系統(tǒng)：Bio－Rad Laboratories，核酸電泳儀：Power pac Bio－Rad Laboratories。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌的分離純化

酸菜汁用無菌水梯度稀釋，稀釋度分別為10－1、10－2、10－3、10－4、10－5，各取 200 μL 倒入含溴甲基酚紫的平板培養(yǎng)皿中，用涂布棒將其涂勻，涂干；涂菌后放入37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。從培養(yǎng)基長勢較好，菌落易分辨的培養(yǎng)基平板上挑起單菌落進行革蘭氏染色、顯微鏡鏡觀察形態(tài)[5]。將革蘭氏陽性菌涂在MRS固體培養(yǎng)基中（涂Z型），隨后放入37℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)48 h。挑選大的球菌反復(fù)在MRS固體培養(yǎng)基上幾次純化篩選。進行3次后，菌落基本純化。將純化的菌接到MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，進行擴大培養(yǎng)[6]。培養(yǎng)48 h進行DNA提取和16S rDNA鑒定。并取適量菌種加甘油于－70℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 乳酸菌的鑒定

1.3.2.1 乳酸菌形態(tài)的觀察

乳酸菌屬在MRS培養(yǎng)基上的菌落大致呈現(xiàn)乳白色，濕潤，桿菌邊緣不整齊，球菌邊緣整齊，直徑在1 mm～3 mm左右。乳酸菌為一類革蘭氏陽性球菌或桿菌[7]。

1.3.2.2 16 S rDNA菌種鑒定[8]

1）引物設(shè)計

根據(jù)細(xì)菌16 S rDNA一端長為1 225 bp保守序列，設(shè)計一對細(xì)菌的通用引物，用于PCR擴增，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。引物序列如下：

引物 1：5′－CCG GAT CCAGAG TTT GAT CAT GGC TCAGCA－3′

引 物 2：5′－CGG GAT CCTACG GCTACC TTG TTACGACTT－3′

2）乳酸菌DNA的提取

參照細(xì)菌提取方法提取乳酸菌DNA[9]。

3）PCR反應(yīng)體系

按表1將下列成分加入PCR管中。

4）PCR擴增程序

按表2進行16 SrDNA PCR擴增。

5）PCR產(chǎn)物的克隆

將PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳后，用膠回收試劑盒回收特異性目的片段。將回收的PCR產(chǎn)物與pMD19－T載體進行連接，反應(yīng)采用10 μL反應(yīng)體系，即：加入 pMD19－T 載體 0.5 μL，PCR 產(chǎn)物 5.0 μL，Ligation solution 4.5 μL，16℃連接過夜。用連接的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布含有AMP的培養(yǎng)基平板，37℃培養(yǎng)12 h～16 h后，挑取白色菌落，進行PCR鑒定。

表116 SrDNA PCR MixTable 1 16S rDNA PCR Mix

表2 16 S rDNA PCR程序Table 2 Procedure of 16 S rDNA PCR

6）16 SrDNA的序列測定及與標(biāo)準(zhǔn)序列的比較

將經(jīng)過鑒定的含重組質(zhì)粒的菌種送華大基因公司進行序列測定。序列測定結(jié)果通過Internet網(wǎng)（http：//www.ncbi.nlm.nih gov/blast.cgi）， 將 所 測 序 列 與Genbank數(shù)據(jù)庫中已報到的序列進行相似性比較。

1.4 產(chǎn)生共軛亞油酸能力的測定

共軛亞油酸在233 nm處有最大吸收峰。用色譜純的正已烷為溶劑，將CLA標(biāo)樣稀釋成不同濃度的溶液，以正已烷為參照，在紫外233 nm處測定CLA（共軛亞油酸）標(biāo)樣溶液的吸光值，以CLA濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。線性回歸方程為y=0.094 6x－0.004 8[10]。

取0.2 mL活化好的菌液，接菌于裝有10 mL篩選培養(yǎng)基的試管中，37℃靜置培養(yǎng)36 h。發(fā)酵結(jié)束后，置于50 mL三角瓶中，加入25 mL正己烷，210 r/min萃取1 h，10 000 r/min離心20 min，以未接種的篩選培養(yǎng)基為參照，取正己烷層，233 nm處測定吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出共軛亞油酸的生成量[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸菜汁中乳酸菌的篩選結(jié)果

2.1.1 溴甲基酚紫培養(yǎng)基培養(yǎng)

通過培溴甲基酚紫培養(yǎng)基初步篩選發(fā)現(xiàn)，10－5稀釋度試管中的菌長勢最好，生長情況如圖1。說明有產(chǎn)酸的細(xì)菌產(chǎn)生。

2.1.2 革蘭氏染色、電鏡觀察

將上述產(chǎn)酸的細(xì)菌進行電鏡觀察，為革蘭氏陽性桿菌，圖2和圖3的菌分別命名為L菌和S菌，均為為短棒狀。

2.1.3 MRS固體培養(yǎng)基培養(yǎng)

純化后的L菌落和純化后的S菌落，見圖4，圖5。

2.2 16 S rDNA鑒定結(jié)果2.2.1 DNA的電泳結(jié)果

對篩選出的L菌和S菌提取DNA電泳檢測結(jié)果如圖6，圖6表明L、S菌的DNA提取成功。

2.2.2 PCR的電泳結(jié)果

以篩選出L、S菌基因組DNA為模板，以特異性引物擴增16 S rDNA片段，結(jié)果如圖7。從圖7可以看出各菌均擴增出約1 300 bp片段，大小與預(yù)期的16Sr-DNA片段一致。

2.2.3 菌落PCR鑒定

菌落PCR電泳圖，見圖8。

菌落PCR結(jié)果如圖8所示，兩個菌株均得到了1.3 kb左右大小的片段，均為陽性克隆，與預(yù)期相符，表明兩株菌株的16 S rDNA均與pMD19-T載體連接成功。

2.2.4 菌株16SrDNA序列測定結(jié)果與比對

將擴增出L、S菌的16 S rDNA片段，送華大基因測序，序列結(jié)果如下：

表3 各菌測序比對結(jié)果Table 3 The sequencing alignment results of the strains

從表3可以看出L、S菌與棒狀乳桿菌的同源性均在99%，初步判斷L、S菌均為棒狀乳桿菌。

2.3 亞油酸異構(gòu)酶酶活測定結(jié)果

發(fā)酵檢測L和S菌株的CLA濃度分別為0.004 4 mg/mL和0.010 7 mg/mL，CLA的轉(zhuǎn)化率分別是1.03%和2.51%。

3 結(jié)論

從自然發(fā)酵酸菜汁中用含溴甲基酚紫培養(yǎng)基只分離出兩株乳酸菌，說明這兩株菌為釀制酸菜過程中的優(yōu)勢菌株。該菌株經(jīng)過革蘭氏染色、電鏡觀察和16 S rDNA菌種鑒定為棒狀乳桿菌（Lactobacillus coryniformis subsp.torquens strain30），經(jīng)測定L和S菌株產(chǎn)CLA分別為0.004 4 mg/mL和0.010 7 mg/mL，CLA轉(zhuǎn)化率分別為1.03%和2.51%；S菌共軛亞油酸的能力較高，在以后的研究中對所選取的反應(yīng)條件和時間進行改進和優(yōu)化，以進一步提高底物的轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物得率，為食品、醫(yī)藥、工業(yè)上的進一步應(yīng)用提供參考。

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[1]王月囡,曹鍵,曾實,等.共軛亞油酸生物合成的研究[J].食品研究與發(fā),2006,27(4):4-8

[2]張浩,曹鍵,常共宇,等.亞油酸異構(gòu)酶研究進展[J].中國油脂,2004,29(10):38-42

[3]李鳳梅,王曉,張雙靈,等.自然發(fā)酵酸菜汁中乳酸菌分離鑒定[J].中國造,2008,5:32-35

[4]畢金峰,劉長江,趙明,等.自然發(fā)酵酸菜汁中乳酸菌的分離、鑒定及發(fā)酵劑的篩選[J].沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2000,31(4):346-349

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[9]F.奧斯伯,R.布倫特,R.E.金斯頓,等.精編分子生物學(xué)實驗指南（顏子穎,王海林譯）[M].北京：科學(xué)技術(shù)出版社,1998:13-50

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[11]張中義,胡錦蓉,劉萍,等.產(chǎn)共軛亞油酸乳酸菌的篩選及產(chǎn)物分析[J].中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2004,9(3):5-8