胡雪蓮,俞漪,曲勤鳳,顧文佳
(上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)技術(shù)研究院,上海 200233)
貝類毒素(Shellfish toxin)是一類由浮游藻類或微生物合成,通過食物鏈傳給貝類,并在其體內(nèi)富集而形成的脂溶性次生代謝生物高分子化合物[1-3]。它的形成與海洋中有毒藻類赤潮密切相關(guān)。常見的貝類毒素包括腹瀉性貝類毒素(DSP)、麻痹性貝類毒素(PSP)、神經(jīng)性貝類毒素(NSP)和健忘性貝類毒素(ASP)等。其中,腹瀉性貝類毒素的存在比較普遍,海產(chǎn)雙殼類、棘皮類、腹足類等軟體動(dòng)物中都曾有檢出該毒素的報(bào)道[4]。近年來對中國沿海部分海域貝類毒素的調(diào)查顯示[5-7],中國沿海部分海域赤潮活動(dòng)平凡,赤潮一旦產(chǎn)生,海產(chǎn)雙殼貝類易受到貝類毒素的威脅。腹瀉性貝類毒素的主要中毒癥狀包括腹瀉(92%)、惡心(80%)、嘔吐(79%)、下腹疼痛(53%)[8]。盡管目前還沒有因DSP中毒致死的報(bào)道,但由于DSP中毒癥狀與細(xì)菌性胃腸炎類似,極易混淆,且發(fā)作時(shí)間短,目前尚無有效的治療藥物,若是延誤治療,會(huì)對健康造成較大的傷害。
目前國內(nèi)外對于DSP的檢測方法以經(jīng)典的小鼠法為主,該方法是AOAC(美國官方化學(xué)家協(xié)會(huì))的標(biāo)準(zhǔn)方法,同時(shí)也是目前唯一被大多數(shù)國家所普遍接受的統(tǒng)一方法。我國國標(biāo)GB/T 18406.4-2001《農(nóng)產(chǎn)品安全質(zhì)量無公害水產(chǎn)品安全要求》及2011年5月17日我國衛(wèi)生部剛公布的《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)貝類中腹瀉性貝類毒素的測定》(征求意見稿)中的檢測方法也都是小鼠法。但該方法存在著很多不足和缺陷,如:僅能指出毒性的大小,無法確定毒素的組成和含量;所測得的毒性和小鼠品系有關(guān),可比性較差,必須進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)毒素校準(zhǔn)才有可能相比;毒性測試所需時(shí)間長,重復(fù)性差;需要受過專門訓(xùn)練的操作人員;小鼠維持費(fèi)用較高,對實(shí)驗(yàn)場地要求較高等[9]。這些不足使得人們希望能有另外一些操作簡便、可比性強(qiáng)、易于普及、對實(shí)驗(yàn)人員和檢測場地要求相對較低的檢測手段來替代小鼠法。
本文在前期研究的基礎(chǔ)上[10],著重比較了兩種貝類毒素DSP的快速篩選檢測方法——酶聯(lián)免疫法和蛋白磷酸酶抑制法,旨在較短時(shí)間內(nèi)對貝類樣品中是否含有DSP進(jìn)行快速篩查,以滿足當(dāng)前食品安全實(shí)時(shí)監(jiān)控的需要。
高純度DSP單標(biāo)OA標(biāo)準(zhǔn)溶液購自瑞士ALEXIS公司,質(zhì)量為50 μg。將OA標(biāo)準(zhǔn)品以1 mL 100%甲醇(分析純)溶解,制成OA母液并分裝,-18℃保存待用。使用時(shí),將母液以1 mL 100%甲醇(分析純)稀釋成OA 濃度為 2 μmol/L(約 1 610 ppb)的中間液,作為標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液及加標(biāo)添加液。
用100%甲醇(分析純)將上述母液配制成濃度分別為 80、100、160、200、240、300 μg/kg 的 OA 標(biāo)準(zhǔn)液,分別以酶聯(lián)免疫法及蛋白磷酸酶抑制法進(jìn)行檢測,每個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品重復(fù)檢測3次。以市售新鮮海產(chǎn)貝類為基質(zhì),將貝類洗凈后去除貝殼,取出所有組織。用濾紙吸干貝肉上的水分,充分搗碎混勻,5.0 g/管分裝至50 mL離心管并高溫滅活。向離心管中添加OA標(biāo)準(zhǔn)品添加液,使 OA 終濃度分別為 80、100、120、140、160、200、240、300 μg/kg,分別以酶聯(lián)免疫法及蛋白磷酸酶抑制法進(jìn)行檢測。每個(gè)模擬樣品重復(fù)檢測5次。
蛋白磷酸酶抑制法檢測選用TOXINLINE-DSP腹瀉性貝類毒素試劑盒(上海千慕生物科技有限公司),樣品前處理及檢測步驟勻按照試劑盒使用說明書進(jìn)行。使用TECAN M200型全波長多功能微孔板分析系統(tǒng)進(jìn)行讀數(shù),激發(fā)波長(360±15)nm,發(fā)射波長(455±20)nm。以試劑盒中標(biāo)準(zhǔn)品OA濃度的對數(shù)值為X軸,熒光讀數(shù)值為Y軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,再由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出所測樣品中的OA含量。
酶聯(lián)免疫法檢測選用ABRAXIS OKADAIC ACID(DSP)ELISA試劑盒,使用TECAN M200型全波長多功能微孔板分析系統(tǒng)于450 nm處進(jìn)行讀數(shù)。以試劑盒中標(biāo)準(zhǔn)品OA濃度為X軸,試劑盒中標(biāo)準(zhǔn)品BX與第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品B0的百分比吸光度值B/B0(%)為Y軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,再由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出所測樣品中的OA含量。
腹瀉性貝類毒素是一類成分十分復(fù)雜的聚醚類或大環(huán)內(nèi)酯類化合物,一般可分為:酸性成分OA(大田軟海綿酸)及其天然衍生物DTX 1~3;中性成分聚醚內(nèi)酯(PTXs);其它成分,如 YTX 等[1-3]。目前已經(jīng)證實(shí)與腹瀉有關(guān)的組分是其中的酸性成分OA及其衍生物DTX-1和DTX-3[3]。因此,選擇OA作為腹瀉性毒素的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行加標(biāo)回收或制備模擬染毒樣品具有較強(qiáng)的代表性。
目前已有13個(gè)國家或組織制定了貝類中DSP的限量標(biāo)準(zhǔn),各國對于DSP的限量標(biāo)準(zhǔn)多數(shù)基于OA及其衍生物的小鼠i.v.LD50和i.p.LD99量而制定。如FDA、日本、加拿大、澳大利亞、新西蘭、朝鮮等制定的DSP 限量為 20 μg/100 g(200 μg/kg);EU、德國、葡萄牙、愛爾蘭、英國等制定的DSP中主要毒性成分OA限量為 16 μg/100 g(160 μg/kg)[11]。我國 GB/T 18406.4-2001《農(nóng)產(chǎn)品安全質(zhì)量無公害水產(chǎn)品安全要求》規(guī)定DSP的限量為 60 μg/100 g(600 μg/kg)。參考國內(nèi)外對貝類中DSP的限量要求,并考慮到本文所涉及兩種方法的實(shí)際檢出限以及該兩種方法主要應(yīng)用于篩選檢測的特點(diǎn),將貝類產(chǎn)品中DSP的陽性檢出限暫定為200 μg/kg。即將篩查結(jié)果低于200 μg/kg的樣品視為DSP陰性,而檢測結(jié)果高于這一數(shù)值的樣品視為可疑陽性。
配制一系列不同濃度的OA標(biāo)準(zhǔn)液,使用上述所述兩種方法進(jìn)行檢測。結(jié)果如表1、表2所示。
表1 蛋白磷酸酶抑制法對OA標(biāo)準(zhǔn)溶液檢測結(jié)果Table 1 The dictation result of OA standard solution by protein phosphatase inhibition assay
由表1、表2可見,分別使用蛋白磷酸酶抑制法和酶聯(lián)免疫法對同一濃度的OA標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行三次測試,結(jié)果具有較好的重復(fù)性。檢測所得出的判定結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度一致,即:標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度≥200 μg/kg的,檢測結(jié)果均為陽性;標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度低于200 μg/kg的,檢測結(jié)果為陰性,未出現(xiàn)陰陽性顛倒錯(cuò)判的情況。三次檢測平均值與實(shí)際濃度之間的誤差在±13%之間,即本方法的檢測準(zhǔn)確率高于85%。當(dāng)OA濃度在200 μg/kg附近時(shí),判定結(jié)果可能出現(xiàn)假陰性或假陽性的情況。
表2 酶聯(lián)免疫法對OA標(biāo)準(zhǔn)溶液檢測結(jié)果Table 2 The dictation result of OA standard solution by ELISA assay
考慮到實(shí)際檢測的對象為貝類樣品,標(biāo)準(zhǔn)溶液與實(shí)物貝類樣品可能會(huì)有一定差異。因此選用市售貽貝貝肉,經(jīng)高溫滅活后添加OA標(biāo)準(zhǔn)溶液,配制成不同濃度的模擬陽性樣品,使用上述所述兩種方法進(jìn)行檢測。結(jié)果如表3、表4所示。
表3 蛋白磷酸酶抑制法對模擬陽性樣品檢測結(jié)果Table 3 The dictation result of man-made poisonous samples by protein phosphatase inhibition assay
表4 酶聯(lián)免疫法對模擬陽性樣品檢測結(jié)果Table 4 The dictation result of man-made poisonous samples by ELISA assay
由表3、表4可見,分別使用蛋白磷酸酶抑制法和酶聯(lián)免疫法對同一濃度的模擬陽性樣品重復(fù)5次檢測,結(jié)果顯示了良好的重復(fù)性。兩種方法的檢測的平均加標(biāo)回收率在±14%之間。檢測的陰陽性判定結(jié)果與加標(biāo)情況相一致,即:加標(biāo)濃度在200 μg/kg及以上的,檢測結(jié)果均為陽性;加標(biāo)濃度低于200 μg/kg的,檢測結(jié)果為陰性,未出現(xiàn)陰陽性顛倒錯(cuò)判的情況。
以3種不同市售貝類為基質(zhì),經(jīng)滅活處理后,制成OA濃度為100、240 μg/kg的模擬樣品,分別交由3名檢驗(yàn)人員在盲樣的情況下使用蛋白磷酸酶抑制法和酶聯(lián)免疫法分別進(jìn)行檢測。結(jié)果如表5、6所示。
由表5、表6可見,兩種方法對3種盲樣樣品的檢測結(jié)果均顯示出良好的重復(fù)性與較高的回收率。在因陽性判斷方面,3名檢驗(yàn)人員的檢測結(jié)果完全一致,即:對于加標(biāo)濃度為100 μg/kg的樣品,判定結(jié)果均為陰性;加標(biāo)濃度為240 μg/kg的樣品,判定結(jié)果均為陽性。此結(jié)果證明,對于DSP含量明顯高于或低于篩選檢出限(200 μg/kg)的樣品,無論使用蛋白磷酸酶抑制法或是酶聯(lián)免疫法檢測,判定結(jié)果都是完全正確的。
綜合表1~表6的結(jié)果顯示,使用蛋白磷酸酶抑制法和酶聯(lián)免疫法都可以對樣品中是否含有腹瀉性貝類毒素(DSP)進(jìn)行定性檢測,并可對樣品中貝類毒素的大致含量進(jìn)行測定。這兩種方法的判定準(zhǔn)確率高,僅當(dāng)DSP濃度在(200±20)μg/kg時(shí),才有可能出現(xiàn)假陰性或假陽性,因此都不失為行之有效的快速篩選方法。使用這兩種篩選方法,以200 μg/kg為陽性篩選檢出限,可以做到將大批量的樣品快速篩查,檢測結(jié)果≤200 μg/kg的樣品,可直接判定為DSP陰性;而檢測結(jié)果>200 μg/kg的樣品應(yīng)判定為DSP可疑陽性,顯示該水產(chǎn)品可能受到腹瀉性貝類毒素DSP的污染。這樣,就可以在盡可能短的時(shí)間內(nèi)排除絕大部分的陰性樣品,并篩選出可能受到污染的可疑陽性樣品,送交有條件的實(shí)驗(yàn)室用其他方法進(jìn)行進(jìn)一步確認(rèn)。從而在最大范圍內(nèi)節(jié)省檢測時(shí)間與人力成本,提高檢測效率。
蛋白磷酸酶抑制法檢測腹瀉性貝類毒素DSP的基本原理是:蛋白磷酸酶可以水解為一種特殊的酶作用物并產(chǎn)生熒光反應(yīng),而DSP毒素的主要活性成分OA、DTX是蛋白磷酸酶的有效抑制劑[12],能不同程度地抑制磷酸酶的活性,其抑制程度與含量相關(guān)。由于該檢測原理基于DSP的生物毒性機(jī)理,測定的是DSP中的毒性活性成分總量,能較真實(shí)地反映出樣品的毒性大小,檢測所產(chǎn)生的假陽性率低。值得指出的是,有研究表明,有些種類的貝類中可能含有某種成分能降低DSP的水解效率,使得本檢驗(yàn)方法未必適合所有的貝類樣品[13]。就檢測時(shí)間與成本而言,使用商業(yè)試劑盒,蛋白磷酸酶抑制法對于單個(gè)樣品的檢測時(shí)間低于4 h,每個(gè)樣品的檢測成本為150元左右。但檢測中所使用的磷酸酶、底物等試劑均為一次性現(xiàn)配現(xiàn)用,從某種程度上提高了該方法的檢測成本。此外,該檢測方法需要用到價(jià)格昂貴的熒光酶標(biāo)儀(全波長多功能微孔板分析系統(tǒng)),這也限制了該方法在基層檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)的開展。
酶聯(lián)免疫法檢測DSP的基礎(chǔ)是抗原抗體反應(yīng),微孔板包被有針對DSP抗體的捕捉抗體,加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品提取液及DSP酶標(biāo)記物,游離DSP與DSP標(biāo)記物競爭DSP抗體,同時(shí)DSP抗體與捕捉抗體連接。再經(jīng)洗滌、發(fā)色、孵育顯色等步驟,最后于450 nm處測量樣品與標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值,通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量計(jì)算。目前,只有OA有商用的配套系列試劑盒出售,所采用的抗體僅與OA反應(yīng),但不與其他毒物如DTX、PTX、YTX反應(yīng),因此專一性較強(qiáng)。酶聯(lián)免疫法適用于所有的貝類樣品。該方法的檢測時(shí)間為4 h~6 h,單個(gè)樣品的檢測成本低于100元,且對檢測儀器要求較低。但由于方法的局限性,在實(shí)際檢測過程中,檢驗(yàn)結(jié)果易受到樣品基質(zhì)的影響而產(chǎn)生較多的假陽性。
綜上所述,使用蛋白磷酸酶抑制法及酶聯(lián)免疫法可以對樣品中是否含有腹瀉性貝類毒素(DSP)進(jìn)行定性檢測,并可以對樣品中貝類毒素的大致含量進(jìn)行測定。與傳統(tǒng)的小鼠法相比,這兩種方法都具有耗時(shí)較短,重復(fù)性較好的優(yōu)點(diǎn)。本文所提出的陽性篩選檢出限(200 μg/kg)遠(yuǎn)低于我國相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定(600 μg/kg),說明該二方法均可作為較理想的篩選方法,在盡可能短的時(shí)間內(nèi)排除絕大部分的陰性樣品,并篩選出可能受到污染的可疑陽性樣品,可以用于滿足世博會(huì)等重大場合對食品安全保障的需求。此外,由于天然含腹瀉性貝類毒素DSP樣品不易獲得,缺乏由天然陽性樣品中得出的檢測數(shù)據(jù),還需要在后期檢測過程中對本檢測方法進(jìn)行完善與補(bǔ)充。
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