丁勇，石孝勇，張新明

（陜西科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，西安陜西 710021）

透明質(zhì)酸（Hyaluronic Acid，簡稱HA）是一種高分子量的線性大分子粘多糖。1934年Meyer和Palmer首先從牛眼玻璃體中分離出透明質(zhì)酸[1]，它是由β-D-葡萄糖醛酸（G1cUA）和β-D-N-乙酰氨基葡萄糖（G1cNAc）所構(gòu)成的雙糖單位重復(fù)交替連接而成的連鎖狀高分子物質(zhì)[2]。透明質(zhì)酸具有特殊的生理作用、流變學(xué)特性和極強的持水保濕能力，廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、食品、化妝品工業(yè)等領(lǐng)域。

透明質(zhì)酸生產(chǎn)主要有動物組織提取法和微生物發(fā)酵法。動物組織原料來源有限，且透明質(zhì)酸的含量少、組織成分復(fù)雜、提取分離困難。而微生物發(fā)酵法所需原料簡單、產(chǎn)量不受原料的限制、能夠生產(chǎn)更高的分子量的透明質(zhì)酸、由于與菌體分離、提取過程簡單，因此發(fā)酵法成為透明質(zhì)酸生產(chǎn)的發(fā)展方向。目前微生物發(fā)酵法生產(chǎn)透明質(zhì)酸的工業(yè)菌株多來源于鏈球菌屬[3-4]，經(jīng)過傳統(tǒng)的物理和化學(xué)誘變方法篩選高產(chǎn)菌株，而誘變方法選擇是否得當(dāng)直接關(guān)系到突變株的性狀表達(dá)。本文利用紫外線、硫酸二乙酯、亞硝基胍處理原始菌株Sz560以期獲得無溶血性、高效生產(chǎn)透明質(zhì)酸的突變體。

1 材料和方法

1.1 菌種

本實驗的菌種來源于陜西科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院保藏的馬腺疫鏈球菌獸疫亞型，實驗室保藏號Sz560。

1.2 培養(yǎng)基

血瓊脂平板：70 mm血平板，購自華美生物有限公司。

種子培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖 20，NaCl 5，蛋白胨 15，酵母膏 10，牛肉膏 10，KH2PO40.5，MgSO4·7H2O 0.2，K2HPO41.5，滅菌前調(diào)整pH7.0，121℃滅菌20 min，冷卻至溫度低于50℃，無菌條件下加人1%優(yōu)級小牛血清。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖 20，NaCl 5，蛋白胨15，酵母膏 10，牛肉膏 10，KH2PO40.5，MgSO4·7H2O 0.2，滅菌前調(diào)整pH7.0，121℃滅菌20 min。

1.3 儀器與設(shè)備

Eppendorf centrifuge 5810R（Eppendorf）、J2-Mc 高速冷凍離心機：美國Beckman公司；SW-CJ-1F超凈工作臺：蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)公司；pHs-ZC型pH計：上海科學(xué)儀器廠。

1.4 致死率

以致死率確定誘變劑量，將誘變后的菌懸液與未經(jīng)誘變的菌懸液經(jīng)適當(dāng)稀釋分別涂布于種子培養(yǎng)基平板上，前者平板上的菌落數(shù)為A，后者平板上的菌落數(shù)為B。計算致死率：

1.5 透明質(zhì)酸分析

Bitter-Muir法[5-6]

1.6 透明質(zhì)酸分析

烏式黏度計法

1.7 菌種的誘變方法

1.7.1 紫外線誘變處理

15 W紫外誘變過程：紫外燈功率15 W，照射距離39 cm，照射前打開紫外燈預(yù)熱20 min，將裝有菌懸液平皿置于磁力攪拌器上，照射 20、30、40、50、60 s，稀釋104～105倍涂布于血平板上，37 ℃避光培養(yǎng) 18 h～32 h。

1.7.2 硫酸二乙酯誘變

取4.5 mL菌懸液加入10%的硫酸二乙酯溶液0.5 mL，混勻放入37℃水浴鍋，50 r/min振蕩水浴10、20、30、40 min；在 4 ℃，6 000 r/min 條件下離心 10 min，去上清；加入1 mL，2.5%硫代硫酸鈉溶液充分混勻，終止誘變反應(yīng)，離心去上清；取1 mL生理鹽水懸浮，稀釋倍數(shù)104～105涂血平板。

1.7.3 亞硝基胍誘變

取1 mL種子培養(yǎng)液，4℃，6 000 r/min離心10 min，去上清；取1 mL濃度為0.1 g/L的亞硝基胍溶液懸浮，立即放入水浴鍋中，50 r/min振蕩水浴10、20、30 min；在4℃，6 000 r/min條件下離心10 min，去上清，加入1 mL，0.1 mol/L，pH6.0的磷酸鹽緩沖液，終止誘變反應(yīng)，立即4℃，6 000 r/min離心10 min，去上清，重復(fù)3次；取1 mL生理鹽水懸浮，經(jīng)37.5℃培養(yǎng)30 min；稀釋 103～104倍涂血平板。

2 結(jié)果與討論

2.1 紫外照射的誘變效應(yīng)

表1為紫外照射時間對致死率的影響，Sz560對紫外照射的耐受性差，照射時間延長，致死率越高，篩選到透明質(zhì)酸產(chǎn)量提高幅度較大的突變株的幾率增加，傳代培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)在致死率高的條件下回復(fù)突變率相應(yīng)增加，照射時間大于80 s，致死率超過99.9%。表2為篩選出透明質(zhì)酸產(chǎn)量有一定提高的突變株菌落形態(tài)特征，主要分為三大類，A類菌落直徑小于原始菌株（菌落直徑2 mm～4 mm，菌落呈乳白色、灰白色、半透明、血平板培養(yǎng)菌落表面較濕潤），其它形態(tài)特征與性狀接近于原始菌株，B類菌落基本接近原始菌株，C類在普通平板培養(yǎng)下，菌落表面有少量褶皺，血平板培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)透明圈直徑減少，清晰度略有下降。

表1 紫外照射時間與致死率的關(guān)系Table 1 Relationship between UV treatment time and the mortality

表2 紫外誘變突變株的菌落形態(tài)特征Table 2 Colony morphology of UV mutant

2.2 硫酸二乙酯的誘變效應(yīng)

表3為硫酸二乙酯水浴處理時間對致死率的影響，前10 min致死率達(dá)到63.05%，隨水浴時間延長致死率非線性同步上升，增加幅度趨緩。表4為篩選出透明質(zhì)酸產(chǎn)量大幅提高的突變株菌落形態(tài)特征，該類菌落直徑僅為原始菌株的30%～50%，菌落呈圓形、表面光滑、挑起有拉絲感、無溶血性透明圈，見圖1。

2.3 亞硝基胍的誘變效應(yīng)

表5為亞硝基胍水浴處理時間對致死率的影響，前10 min致死率達(dá)到69.08%，隨水浴時間延長致死率非線性同步上升，增加幅度趨緩。表6為篩選出透明質(zhì)酸產(chǎn)量大幅提高的突變株菌落形態(tài)特征，菌落直徑、形態(tài)差異性較大，菌落呈圓形、表面光滑、挑起有拉絲感、無溶血性透明圈。

表3 DES處理時間與致死率的關(guān)系Table 3 Relationship between DES treatment time and the mortality

表4 硫酸二乙酯誘變突變株的菌落形態(tài)特征Table 4 Colony morphology of DES mutant

表5 亞硝基胍處理時間與致死率的關(guān)系Table 5 Relationship between NTG treatment time and the mortality

2.4 透明質(zhì)酸生產(chǎn)菌復(fù)篩

3種誘變方法得到的生產(chǎn)性狀最好的突變菌株與原始菌株對比，由表7可知，NTG誘變得到的突變株透明質(zhì)酸產(chǎn)量和相對分子量提高幅度大，因而確定NTG為高產(chǎn)透明質(zhì)酸生產(chǎn)菌的右邊手段。

表6 亞硝基胍誘變突變株的菌落形態(tài)特征Table 6 Colony morphology of NTG mutant

表7 突變株復(fù)篩結(jié)果Table 7 Result of mutant re-screening

2.5 遺傳穩(wěn)定性試驗

紫外誘變、硫酸二乙酯誘變、亞硝基胍誘變得到的各一支產(chǎn)量表達(dá)提高的突變菌株進行了傳代試驗，結(jié)果如圖3所示。亞硝基胍誘變的突變株產(chǎn)量高、遺傳穩(wěn)定性好，五代培養(yǎng)后產(chǎn)量下降幅度小于10%，生物量下降幅度小于15%。亞硝基胍誘變得到的突變株所做的遺傳穩(wěn)定性實驗，由圖4可知，隨著傳代次數(shù)的增加，透明質(zhì)酸分子量與產(chǎn)量下降，在第六代透明質(zhì)酸的產(chǎn)量與分子量下降幅度大，因此生產(chǎn)條件下五代以后要重新活化培養(yǎng)。

2.5 誘變方法對比

誘變菌株均采用對數(shù)生長期，代謝旺盛，生物活性高，易變異[7]。紫外線誘變使DNA分子形成嘧啶二聚體使雙鏈結(jié)構(gòu)扭曲變形，阻礙堿基間的正常配對、引起堿基轉(zhuǎn)換、顛換、移碼突變或缺失產(chǎn)生突變株，紫外誘變致死效果明顯，突變體類型較多，正突變率遠(yuǎn)小于負(fù)突變率，回復(fù)突變率也很高，遺傳性狀不穩(wěn)定，單一使用效果差。硫酸二乙酯和亞硝基胍屬于烷基化試劑，使堿基許多位置上增加了烷基引起DNA分子錯配從而獲得突變株，硫酸二乙酯主要引起點突變，而亞硝基胍可作用于復(fù)制叉附近，引起多重突變株出現(xiàn)，因此出現(xiàn)菌落形態(tài)特征明顯不同的突變株。

3 結(jié)論

誘變育種是工業(yè)微生物育種的重要手段，本次試驗考察了紫外誘變、硫酸二乙酯、亞硝基胍3種誘變劑對透明質(zhì)酸產(chǎn)生菌馬腺疫鏈球菌獸疫亞型（Streptococcus zooepidemicus）Sz560進行誘變處理，通過傳代、發(fā)酵等試驗驗證誘變效果，對比得出：

1）3種誘變方法對透明質(zhì)酸產(chǎn)生菌顯示出較大的差異，從溶血性角度看硫酸二乙酯降低溶血性效果好，經(jīng)過3輪誘變篩選到無溶血性菌株，亞硝基胍經(jīng)過6～10輪誘變篩選到無溶血性菌株，紫外誘變沒有篩選到無溶血性菌株；從透明質(zhì)酸產(chǎn)量及分子量增幅角度看依次為：亞硝基胍＞硫酸二乙酯＞紫外誘變。其中，采用亞硝基胍誘變得到一支突變株，搖瓶培養(yǎng)的條件下透明質(zhì)酸產(chǎn)量達(dá)到0.498 mg/mL，分子量1.12×106u。

2）對照血平板和普通平板的菌落形態(tài)，高產(chǎn)菌株的菌落表面濕潤、光滑，接種針挑起有明顯的拉絲狀態(tài)，菌落的黏性大，這直接可提供比對參考，作為平板分離初篩高產(chǎn)透明質(zhì)酸突變體的依據(jù)，從而避免較為復(fù)雜、耗時的透明質(zhì)酸的化學(xué)分析檢測，降低篩選的工作強度。誘變過程出現(xiàn)菌落直徑縮小、凸起更明顯、菌落褶皺平鋪形態(tài)的多種突變體，這種突變體與溶血性及產(chǎn)量沒有趨勢性關(guān)系。

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[1]Meyer K,Palmer J W.The Polysaccharide of the vitreous humor[J].BioChem,1934,10(7):629－634

[2]LaurentTC.BiochemistryofHyaluronan[J].ActaOtolaryngol（Stockh）,1987,44(2):7－12

[3]郭學(xué)平，凌沛平，王春喜，等.透明質(zhì)酸的生產(chǎn)[J].藥物生物技術(shù),2000,7(1):61－63

[4]Barrie F C,Lars M B,Richard M.Microbialhyaluronic acid production[J].ApplMicro Biot,2004,66(4):341－351

[5]凌沛學(xué).透明質(zhì)酸[M].北京：中國輕工業(yè)出版社,2000:41－42

[6]Bitter T,Muri H M.A modified uronic acid carbazole reaction[J].Anal Biochem,1962,4(6):330－334

[7]丁東紅，徐文靜,等.利用玉米漿發(fā)酵生產(chǎn)類胡蘿卜素紅酵母的誘變選育,2010,21(9):159－162