王少華，張慧，郭承華，*

（1.中國(guó)海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院，山東青島 266003；2.煙臺(tái)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東煙臺(tái) 264005）

馬糞海膽（Hemicentrous pulcherrimus），屬于棘皮動(dòng)物門（Echinodermata），海膽綱（Echinoidea），是中國(guó)及日本沿海的特有品種，主要分布在我國(guó)黃渤海沿岸、浙江、福建沿海以及日本。有關(guān)馬糞海膽生殖腺營(yíng)養(yǎng)成分、粗多糖提取工藝等已有研究報(bào)道[1-2]，但對(duì)馬糞海膽生殖腺粗多糖的抑菌和抗氧化活性的研究未見報(bào)道。

自由基學(xué)說[3]認(rèn)為機(jī)體在生命活動(dòng)過程中會(huì)不斷的產(chǎn)生氧自由基，這些自由基時(shí)刻危害著人類的健康。在正常機(jī)體中，氧自由基的數(shù)量始終處于機(jī)體自身維持的穩(wěn)定狀態(tài)，但當(dāng)機(jī)體功能出現(xiàn)異?；驌p壞時(shí)，這些氧自由基的數(shù)量就會(huì)大增，引起一系列疾病[4]。因此，開發(fā)抗氧化藥物已受到越來越多的關(guān)注[5]。隨著社會(huì)的發(fā)展，一些由細(xì)菌和真菌引起的疾病也越來越受到人們的重視，隨著陸地藥物的大量開采和化學(xué)藥劑所帶來的負(fù)面影響越來越大，尋找一種來源便利廣泛，且無毒副作用的新型藥物迫在眉睫。本文以黃海海域馬糞海膽生殖腺作為實(shí)驗(yàn)材料，首次對(duì)其由不同提取方法得到的粗多糖進(jìn)行抑菌和抗氧化活性測(cè)定，為馬糞海膽資源的開發(fā)利用提供必要的數(shù)據(jù)支持和理論參考。

1 材料、儀器及試劑

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)用材料鮮馬糞海膽：市售，2009年4月購(gòu)于煙臺(tái)市芝罘區(qū)紅利海鮮市場(chǎng)。

1.2 主要儀器

Rotavapor R－220：瑞士 BUCHI公司；RE－52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；微弱發(fā)光儀BPCL－2－G：中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所；精密pH計(jì)：新加坡EUTECH公司；DFZ－6020型真空干燥箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司。

1.3 試劑

大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、假絲酵母菌、啤酒酵母菌、黃曲霉、黑曲霉由煙臺(tái)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室梁麗琨副教授提供。所用試劑均為分析純。

2 方法

2.1 多糖的提取

取新鮮馬糞海膽，破開外殼，取出黃色的生殖腺，剔除黑色的內(nèi)臟等其他雜質(zhì)，烘干，粉碎復(fù)溶，離心取上清，室溫條件下等體積丙酮浸泡8 h脫脂，將殘?jiān)栏珊螅?0 ℃水浴，料水比為 1∶20，攪拌浸提 4 h，重復(fù)3次，合并提取液并濃縮，將殘?jiān)?%NaOH，料水比為1∶20，低溫浸泡4 h，重復(fù)3次，合并提取液并濃縮。將兩份提取液用Sevag法脫蛋白[6]。分別向脫蛋白后的提取液中加入乙醇，使溶液的終乙醇濃度分別為50%、70%、90%，分別收集醇沉后的沉淀，干燥，得6種粗多糖，即50%水提多糖，命名為S5，70%水提多糖，命名為S7，90%水提多糖，命名為S9；50%堿提多糖，命名為J5，70%堿提多糖，命名為J7，90%堿提多糖，命名為J9。采用苯酚－硫酸法測(cè)定多糖含量[7]。

2.2 抗氧化活性及抑菌活性的測(cè)定

對(duì) S5、S7、S9、J5、J7、J9 的還原能力的測(cè)定采用參考文獻(xiàn)的鐵氰化鉀反應(yīng)體系[8]進(jìn)行測(cè)定。對(duì)S5、S7、S9、J5、J7、J9的羥自由基的清除能力的測(cè)定采用參考文獻(xiàn)的鄰二氮菲－金屬鐵離子－過氧化氫法[9]進(jìn)行。對(duì)S5、S7、S9、J5、J7、J9 的超氧離子清除能力的測(cè)定采用參考文獻(xiàn)的鄰苯三酚自氧化法反應(yīng)體系[10]進(jìn)行。以上測(cè)定均采用 VC做為陽性對(duì)照。對(duì) S5、S7、S9、J5、J7、J9 的抑菌活性的測(cè)定采用參考文獻(xiàn)的濾紙片法[11]進(jìn)行。采用氯霉素（細(xì)菌）和硝酸咪唑康（真菌）做為陽性對(duì)照。

3 結(jié)果與討論

3.1 苯酚硫酸法測(cè)定多糖含量結(jié)果

苯酚－硫酸法測(cè)定多糖含量回歸方程Y=8.1723X－0.056 7（R2=0.999 2），式中：Y 為吸光度；X 為糖濃度，單位為mg/mL。硫酸苯酚法測(cè)定糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

根據(jù)回歸方程，求得 S5、S7、S9 和 J5、J7、J9 多糖濃度分別為1.98、2.09、2.92mg/mL 和1.78、2.19、2.25mg/mL。

3.2 抗氧化活性及抑菌活性測(cè)定結(jié)果

3.2.1 還原能力的測(cè)定結(jié)果

采用鐵氰化鉀法測(cè)定 S5、S7、S9、J5、J7、J9 的還原能力，實(shí)驗(yàn)測(cè)得的S5、S7和S9的吸光度分別為0.17、0.32和 0.36，J5、J7和 J9的吸光度分別為 0.23、0.35和0.45，均為正值，說明 S5、S7、S9、J5、J7、J9 均具有還原能力，且其還原能力大小順序?yàn)椋篔9＞S9＞J7＞S7＞J5＞S5。

3.2.2 對(duì)羥基清除能力的測(cè)定結(jié)果

采用鄰二氮菲－金屬鐵離子－過氧化氫法測(cè)定S5、S7、S9、J5、J7、J9 對(duì)羥基的清除能力，結(jié)果如圖 2 所示。

由圖 2 可知，S5、S7、S9、J5、J7、J9 對(duì)羥基均具有不同程度的清除作用，在粗多糖濃度為0～4 mg/mL時(shí)，S9對(duì)羥基的清除作用最大，S5次之。其余波動(dòng)較大，且相差不大。在粗多糖濃度為4 mg/mL～8 mg/mL時(shí)，S5、S7、S9、J5、J7、J9 對(duì)羥基的清除作用的大小順序?yàn)椋篠5＞S9＞J7＞S7＞J9＞J5。在粗多糖濃度為 10 mg/mL到實(shí)驗(yàn)設(shè)置的最大多糖濃度12 mg/mL時(shí)，S5、S7、S9、J5、J7、J9 對(duì)羥基的清除作用的大小順序?yàn)椋篔9＞S9＞J5＞S7＞J7＞S5。

3.2.3 對(duì)超氧離子清除能力的測(cè)定結(jié)果

采用鄰苯三酚自氧化法測(cè)定 S5、S7、S9、J5、J7、J9對(duì)超氧離子的清除能力，其結(jié)果如圖3所示。

由圖 3 可知，S5、S7、S9、J5、J7、J9 對(duì)超氧離子均具有不同程度的清除作用，在粗多糖濃度為0～7 mg/mL時(shí)，J7對(duì)超氧離子的清除作用最大，S9次之，J9第三。其余波動(dòng)較大，且相差不大。在粗多糖濃度為7 mg/mL～8 mg/mL 時(shí)，S5、S7、S9、J5、J7、J9 對(duì)羥基的清除作用的大小順序?yàn)椋篠9＞J7＞J9＞S7＞J5＞S5。在粗多糖濃度為8 mg/mL～9 mg/mL 時(shí)，S5、S7、S9、J5、J7、J9 對(duì)羥基的清除作用的大小順序?yàn)椋篠9＞J9＞J7＞S7＞J5＞S5。在粗多糖濃度為10.5 mg/mL到實(shí)驗(yàn)設(shè)置的最大多糖濃度12 mg/mL時(shí)，其對(duì)羥基的清除作用的大小順序?yàn)椋篔9＞S9＞S7＞J5＞J7＞S5。

3.2.4 抑菌活性的測(cè)定結(jié)果

采用濾紙片法對(duì)6種多糖提取液進(jìn)行了抑菌活性的測(cè)定，結(jié)果如表1所示。

由表1可知，6種多糖提取液對(duì)細(xì)菌和真菌均有不同程度的抑菌作用。對(duì)金黃色葡萄球菌來說，J9的抑菌活性最強(qiáng)，依次為 S9、J7、S7、J5、S5 的抑菌活性最小，大腸桿菌亦然；而對(duì)黃曲霉、黑曲霉、啤酒酵母菌和假絲酵母菌的作用結(jié)果均顯示，J9的抑菌活性最強(qiáng)，其次為 J7，在其次分別為 S9、S7、J5，S5 的抑菌活性最小。

4 結(jié)論

通過上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，馬糞海膽生殖腺的粗多糖提取物具有抗氧化還原活性和抑菌活性。無論是在抗氧化還原方面，還是抑菌方面，J9的活性都是最大的，其次S9和J7表現(xiàn)也都很突出，這為以后更深層次的研究馬糞海膽生殖腺粗多糖的抗氧化和抑菌機(jī)理和進(jìn)一步更好的發(fā)展海膽資源提供了基礎(chǔ)的理論數(shù)據(jù)。

表1 不同多糖的抑菌效果對(duì)比Table 1 The comparison of the bacteriostasis resuits by different polysaccharides cm

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