吳超，徐凌剛，何杭生，毛燕

（浙江農(nóng)林大學(xué) 理學(xué)院，浙江 臨安 311300）

葛別名甘葛、野葛等，為豆科葛屬植物，葛Pueraria lobata（Willd）Ohwi in bull。產(chǎn)于我國(guó)南北各地，除新疆、青海和西藏外，分布全國(guó)。葛根供藥用，有解表退熱，生津止渴，止瀉的功能，并能改善高血壓病人的項(xiàng)強(qiáng)、頭昏、頭痛、耳鳴等癥狀[1]。葛葉有收斂止血、消腫止痛等作用。

黃酮類(lèi)化合物是一類(lèi)廣泛存在的化合物，具有廣泛的生理及藥理活性，包括抗炎、抗腫瘤、抗衰老、抗病毒、抗氧化作用[2]，有些黃酮類(lèi)化合物具有利尿和調(diào)節(jié)血管滲透性的作用，有的具有抑制癌細(xì)胞的作用[3]。目前從中草藥提取分離黃酮類(lèi)化合物報(bào)道較多，從五加科植物刺五加的花、葉及其果實(shí)中[4]、洋蔥[5]、山核桃皮中[2]、翻白草[6]提取分離出具有生物活性的黃酮類(lèi)化合物。對(duì)葛葉和葛蔓的總黃酮類(lèi)化合物的提取尚鮮見(jiàn)報(bào)道。本文采取不同的條件對(duì)葛葉、葛蔓總黃酮進(jìn)行提取測(cè)定，用以討論從植物中提取同類(lèi)化合物的應(yīng)用價(jià)值，旨在為植物中有效成分研究和開(kāi)發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料采集

2008年10月在浙江林學(xué)院東湖區(qū)校園內(nèi)，分別從葛上摘取葛葉和葛蔓。樣品洗凈，烘干，分別粉碎后裝入干燥的磨口瓶中備用。在試驗(yàn)的同時(shí)測(cè)定含水率。葛葉樣品含水率為11.79%，葛蔓樣品含水率為2.85%。

1.2 提取方法

熱水提取。分別稱(chēng)取試樣品1.0 g，在水浴中以不同的時(shí)間、不同的溫度和不同體積的水提取，過(guò)濾。濾液定容，待測(cè)總黃酮含量。

1.3 分析方法

以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)樣品，采用比色法對(duì)各提取液中的總黃酮含量進(jìn)行測(cè)定[7]。

2 結(jié)果和分析

2.1 總黃酮提取的單因素影響

2.1.1 不同提取溫度對(duì)提取總黃酮提取率的影響

取樣品1.0 g，加水50 mL，分別在不同的溫度下提取60 min，然后測(cè)定總黃酮含量，見(jiàn)圖1。

圖1 不同的溫度條件下提取的總黃酮提取率Fig.1 Effect of temperature on total flavone content

從圖1中得出，隨著溫度的升高，葛葉的總黃酮提取率也隨之增加。當(dāng)溫度在100℃時(shí)，總黃酮提取率達(dá)到最大值，表明溫度升高有利于葛葉的總黃酮提取。而葛蔓的總黃酮提取卻在80℃時(shí)，提取率最高，隨著溫度增高，含量降低。結(jié)果表明，溫度升高對(duì)葛葉的影響較為顯著，而對(duì)葛蔓沒(méi)有大的影響，因此，兩者的總黃酮提取溫度應(yīng)選擇在80℃～100℃。

2.1.2 不同時(shí)間對(duì)提取總黃酮提取率的影響

取樣品1.0 g，加水50 mL，水浴溫度100℃，分別以不同時(shí)間提取，試驗(yàn)重復(fù)2次，然后測(cè)定總黃酮提取率，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2不同的時(shí)間條件下提取的總提取率Fig.2 Effect of extracting on total flavone content

圖2的結(jié)果表明，提取時(shí)間對(duì)葛葉總黃酮提取率有所影響，而對(duì)葛蔓的總黃酮提取率影響不大，在提取時(shí)間為30 min時(shí)，葛葉的總黃酮提取率最高，隨著時(shí)間延長(zhǎng)葛葉總黃酮提取率隨之減少。說(shuō)明提取時(shí)間達(dá)到一定程度時(shí)，由于某些黃酮類(lèi)化合物的熱穩(wěn)定性較差，加熱時(shí)間長(zhǎng)容易分解，導(dǎo)致總黃酮提取率降低。說(shuō)明提取時(shí)間達(dá)到一定時(shí)總黃酮的提取已基本完成。對(duì)葛蔓來(lái)說(shuō)，在提取時(shí)間為30 min時(shí)，總黃酮提取率最高，隨著時(shí)間延長(zhǎng)葛蔓總黃酮提取率略有降低并基本保持不變，說(shuō)明延長(zhǎng)提取時(shí)間意義不大，故兩者的提取時(shí)間為30 min～40 min為宜。

2.1.3 不同的溶劑體積對(duì)提取總黃酮提取率的影響

取樣品1.0 g，加熱水，分別用不同的體積提取，溫度100℃，提取時(shí)間為60 min，所得結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 不同的容積體積條件下提取的總黃酮提取率Fig.3 Effect of solvent volume on total flavone content

由圖3可知，隨著溶劑體積的增加，葛葉和葛蔓的總黃酮提取率也隨之增加，溶劑體積為60 mL時(shí)，葛葉的總黃酮提取率最高，而在50 mL～60 mL時(shí)，葛蔓的總黃酮提取率最高，表明兩者提取的溶劑體積都有各自的最佳選擇，即以50 mL為好。故而，溶劑體積選擇范圍可設(shè)定為50 mL～60 mL。

2.2 綜合試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案的確立

根據(jù)上述各種因素影響的試驗(yàn)結(jié)果，綜合考慮采用二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)[7－8]，進(jìn)一步考察提取時(shí)間、提取溫度，及溶劑體積對(duì)提取效果的影響。用MATLABSU數(shù)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，X1（℃）、X2（min）、X3（mL）分別表示溫度、時(shí)間和溶劑體積分?jǐn)?shù)，y/%表示產(chǎn)率，考慮溫度變化范圍為20℃～100℃，時(shí)間變化范圍為20 min～60 min，溶劑體積變化范圍為20 mL～60 mL。各因素水平編碼值如表1全部試驗(yàn)設(shè)計(jì)20個(gè)處理，其中15～20號(hào)為零水平處理。試驗(yàn)方案及結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)因素水平編碼表mLTable 1 Coding value of current spinning combination design

2.3 綜合試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析

通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)方案及結(jié)果，見(jiàn)表2。

從表2中可以看出，在提取時(shí)間和溶劑體積相同的條件下，9號(hào)與10號(hào)比較，葛葉的提取率提高126%，而葛蔓的產(chǎn)率提高6.25%，說(shuō)明提取溫度對(duì)葛葉總黃酮提取率有顯著影響，對(duì)葛蔓卻影響不大。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可看出，隨著溫度的升高產(chǎn)率增加。其次，11號(hào)與12號(hào)比較，提取溫度和溶劑體積相同的條件下，提取時(shí)間的增加葛葉的產(chǎn)率提高38%，葛蔓的產(chǎn)率提高6.25%。說(shuō)明提取時(shí)間對(duì)葛葉影響較大，而對(duì)葛蔓的影響不大。3號(hào)與4號(hào)比較，在提取溫度和提取時(shí)間相同的條件下，溶劑體積的增加葛葉的產(chǎn)率提高8.3%，葛蔓的產(chǎn)率提高20%，說(shuō)明溶劑體積對(duì)葛蔓的影響較大。

表2 通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 2 Scheme and result of current spinning combination design

2.4 進(jìn)一步對(duì)葛葉、葛蔓的試驗(yàn)結(jié)果作統(tǒng)計(jì)分析

2.4.1 根據(jù)表2試驗(yàn)結(jié)果建立三元二次回歸方程

2.4.2 回歸方程的顯著性檢驗(yàn)

由樣本數(shù)據(jù)計(jì)算得回歸關(guān)系顯著性檢驗(yàn)值為：葛葉F=14.71，葛蔓：F=7.355 4，臨界值F0.01（9，10）=4.94，所以F＞F0.01，表明葛葉、葛蔓對(duì)試驗(yàn)結(jié)果均有顯著影響。

2.4.3 各回歸系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)

回歸方程中各變量作用的大小可通過(guò)t值檢驗(yàn)來(lái)判斷，t值檢驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)Table 3 The t test result of regression coefficient

對(duì)于葛葉，其中x1（溫度）及x12對(duì)產(chǎn)率y有顯著的影響，其它的因素對(duì)產(chǎn)率影響較小，亦即產(chǎn)率與溫度之間存在顯著關(guān)系，溫度升高，產(chǎn)率增大，為此，我們將t檢驗(yàn)值小于1的變量刪去，于是回歸方程優(yōu)化為

對(duì)于葛蔓，其中x3（體積），x1x3及x32對(duì)產(chǎn)率y有極顯著影響，x12對(duì)產(chǎn)率y有顯著影響，其他因素均無(wú)顯著影響，因而可將t檢驗(yàn)值小于1的變量從回歸方程中刪去，于是回歸方程優(yōu)化為

利用回歸方程計(jì)算不同組合的擬合值推求最優(yōu)方案，在X的編碼區(qū)間-1.682≤xi≤1.68，取步長(zhǎng)為0.42，計(jì)算不同搭配組合時(shí)的總黃酮提取率擬合值共93=729個(gè)值。對(duì)于葛葉，其中產(chǎn)率≥1.10%的有102個(gè)，在這102個(gè)中x1（溫度）編碼值在1.258以上的占98%，x2（時(shí)間）編碼在0.418以上占67%，體積編碼均勻分布，說(shuō)明產(chǎn)物與體積無(wú)關(guān)。綜合實(shí)驗(yàn)條件可采取提取溫度以80℃～100℃，時(shí)間以 40 min～60 min，體積 40 mL～60 mL為宜。

對(duì)于葛蔓，其中產(chǎn)率≥0.175%的有150個(gè)，在這150個(gè)中x3（體積）編碼在0.418以上的占97%，x1（溫度）編碼在0.148以上的占78.7%，x2（時(shí)間）編碼均勻分布，即與時(shí)間無(wú)關(guān)，綜合試驗(yàn)條件可采取提取溫度以80℃～100℃，體積40 mL～60 mL為宜，時(shí)間以40 min～60 min。

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，影響葛葉總黃酮提取率的主要因素是提取溫度，其次是提取時(shí)間，總黃酮提取率隨溫度升高，提取時(shí)間延長(zhǎng)而增加，影響最小的是溶劑體積。而三者因素對(duì)葛蔓的影響均不大，因此，根據(jù)實(shí)驗(yàn)的實(shí)際情況可將提取溫度設(shè)定為80℃～100℃、提取時(shí)間為 30 min～40 min、溶劑體積為 50 mL～60 mL，即可達(dá)到最佳的提取效果。

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