蔡群芳，李淑琴，黃用豪

(1.海南醫(yī)學院熱帶醫(yī)學與檢驗醫(yī)學院，海南?？?71199；2.海南農(nóng)墾中學，海南?？?70226；3.海南省熱帶病重點實驗室，海南?？?71199)

海南島庫蚊和伊蚊基因組彈狀病毒核蛋白內生病毒片段的鑒定和特征描述

蔡群芳1，李淑琴2，黃用豪3*

(1.海南醫(yī)學院熱帶醫(yī)學與檢驗醫(yī)學院，海南海口571199；2.海南農(nóng)墾中學，海南?？?70226；3.海南省熱帶病重點實驗室，海南?？?71199)

目的鑒定和特征描述海南島蚊子基因組彈狀病毒核蛋白內生病毒片段。方法收集海南島內的庫蚊、伊蚊和按蚊，分別提取各類蚊子的總基因組，以此為模板PCR擴增彈狀病毒類核蛋白內生病毒片段，并通過測序和分子生物學方法對其特征進行鑒定和描述。結果在海南島庫蚊和伊蚊基因組中獲得彈狀病核蛋白內生病毒片段，采用測序和分子生物學方法分析和鑒定了該內生病毒片段在進化上高度保守。結論數(shù)據(jù)分析證明蚊子基因組彈狀病毒核蛋白內生病毒片段與弗蘭德斯病毒(Flanders virus)相關，這種病毒在海南島還沒見報導過；初步表明蚊子基因組彈狀病毒核蛋白內生病毒片段是在蚊子擴散到海南島來之前就已經(jīng)整合到蚊子基因組當中的。

彈狀病毒；核蛋白；內生病毒片段；基因組；蚊子

單個病毒基因或是整個病毒基因組在感染宿主時會整合到宿主生殖細胞基因組當中，這些整合到宿主基因組中的病毒基因片段或是整個病毒基因組，稱之為內生病毒片段(Endogenous viral elements，EVEs)，它如宿主其他的基因片段可以進行垂直遺傳[1-2]。內生病毒片段被認為是古代基因的生物化石，能夠反映宿主和病毒之間的進化關系[3-5]。最早鑒定和描述的內生病毒片段是類逆轉錄酶病毒片段。人們在許多動物基因組里發(fā)現(xiàn)很多來源于逆轉錄病毒基因的內生病毒片段[6-7]，人類基因組中有大約8%的基因片段是由來源于逆轉錄病毒基因的內生病毒片段組成[8-9]。據(jù)最近報道，哺乳動物基因組中含有許多來源于非逆轉錄病毒的內生病毒片段，其中博爾納病毒(Borna-like NP elements，EBLNs)核蛋白內生病毒片段研究最廣泛[10-11]。

蚊子能夠傳播多種病毒包括黃病毒屬和彈狀病毒屬。在病毒和蚊子長期的相互作用中，會有許多病毒片段整合到蚊子基因組當中。報道稱在伊蚊基因組內發(fā)現(xiàn)大量與黃病毒屬相關的內生病毒片段[12-13]。以前通過實驗證實的在蚊子基因組內與彈狀病毒屬相關的內生病毒片段很少，但隨著分子生物學和生物信息學的發(fā)展，人們通過分子生物信息學方法對蚊子基因組進行分析發(fā)現(xiàn)蚊子基因組內同樣含有大量的與彈狀病毒屬相關的內生病毒片段，尤其是彈狀病毒核蛋白內生病毒片段在蚊子的基因組中含量豐富[14]。

在本文中，我們對海南島蚊子基因組彈狀病毒核蛋白內生病毒片段進行研究，我們通過實驗證明在伊蚊和庫蚊基因組內發(fā)現(xiàn)彈狀病毒核蛋白內生病毒片段，而在按蚊中沒有發(fā)現(xiàn)這些內生病毒片段；另外我們分析證明了這些內生病毒片段在進化上比較保守。

1 材料與方法

1.1 樣品收集收集海南島內的蚊子，按種類、性別和地理位置對其進行分類，每一類以50只為一組。

1.2 蚊子基因組的提取利用德國QIAgen高通量研磨器(Mixer Mill MM300)對蚊子進行研磨，利用基因組提取試劑盒對蚊子總基因組進行提取，并純化。

1.3 PCR方法按1.2步驟提取的蚊子基因組作為模板；按常規(guī)的PCR方法擴增蚊子基因組中彈狀病毒核蛋白基因片段；利用引物C1(5'-ATGTACGTGAGTGACAGCTT-3')和C2(5'-TCACATTTGCTGAATGGTCC-3')擴增伊蚊基因組中的彈狀病毒核蛋白基因片段；利用引物A1(5'-ATGGCACAAGCGGAAATTAA-3')和A2(5'-CTAGGGTTGTCCGCCCA-3')擴增庫蚊基因組中的彈狀病毒核蛋白基因片段。

1.4 測序與序列分析回收陽性克隆，寄給生物公司進行測序。應用EditSeq和SeqMan software (DNASTAR Inc)這兩種軟件對序列進行分析，通過BLASTn和BLASTp兩種軟件進行比對分析。所參考的彈狀病毒序列在基因庫(GenBank)中都有記錄。

1.5 系統(tǒng)進化樹的構建應用Clustal W(Version 1.74)和MEGA(Version 4.0)兩種軟件構建彈狀病毒核蛋白內生病毒片段系統(tǒng)進化樹。

2 結果

2.1 蚊子基因組彈狀病毒核蛋白內生病毒片段擴增分子生物學和基因組學方法分析表明蚊子基因組內含有一些與彈狀病毒核蛋白基因相關的內生病毒片段，為了證實這些片段的存在，我們利用PCR技術擴增蚊子基因組彈狀病毒核蛋白內生病毒片段。如圖1所示，在伊蚊和庫蚊基因組中擴增出彈狀病毒核蛋白內生病毒片段，而在按蚊基因組中沒有擴增出來，這說明了彈狀病毒與蚊子種類之間存在相對特異性。

2.2 與基因庫中所有記錄的彈狀病毒核酸蛋白基因片段的比對氨基酸序列分析表明，所擴增的基因片段與基因庫中伊蚊氨基酸序列比對為96%(登錄號XP_ 001657655.1)，與庫蚊氨基酸序列比對為97%(登錄號XP_001851570.1)，說明它們在進化上是比較保守的。這兩個擴增的序列都含有完整的閱讀框，分別含有468個氨基酸和479個氨基酸。

為了鑒定所擴增的基因片段與哪些彈狀病毒相關，我們用所擴增的片段與基因庫中所有記錄的彈狀病毒核酸蛋白基因片段進行比對分析，如圖2所示，所擴增的基因片段與弗蘭德斯病毒(Flanders virus)極大相關，相似率達到45%。

圖2 海南島蚊子基因組彈狀病毒核蛋白內生病毒片段與弗蘭德斯病毒(Flanders virus)核蛋白基因序列相關性分析。

2.3 所有蚊子真核細胞染色體的比對分析利用tblastn軟件對所有的真核細胞染色體進行比對分析，如表1所示，存在于蚊子基因組中的彈狀病毒核蛋白內生病毒片段也存在于硬蜱基因組當中。

表1 蚊子基因組和硬蜱基因組中的彈狀病毒核蛋白內生病毒片段

2.4 對彈狀病毒核蛋白序列進行系統(tǒng)進化樹分析對彈狀病毒核蛋白序列進行系統(tǒng)進化樹分析，如圖3所示，整合到蚊子基因組中的彈狀病毒核蛋白序列與狂犬病毒屬和果蠅sigma病毒同處于一個分支。

圖3 彈狀病毒核蛋白內生病毒片段系統(tǒng)進化樹分析

3 討論

來自泰國、德克薩斯(美國)、喀麥隆、馬達加斯加、日本、泰國、馬達加斯加、意大利和法國不同地域的白紋伊蚊基因組中都能擴增出名為細胞沉默劑病毒(Aedes albopictus cell silent agent，CSA)的基因片段，并且這些片段在地域上是高度保守的[12]。但是Roiz等[13]報道一些整合在意大利的白紋伊蚊基因組中黃病毒內生病毒片段可以形成新的一個分類，這個分支在進化上是獨立的，這些數(shù)據(jù)表明蚊子宿主和病毒之間存在著相對特異性。此外，新整合事件，或是獨立的整合事件或是一些不穩(wěn)定的內生病毒片段也造成了地域上基因庫中的內生病毒片段的差異性[15-16]。我們實驗結果表明彈狀病毒核蛋白內生病毒片段在地域上是高度保守的。此外，本實驗還發(fā)現(xiàn)蚊子基因組彈狀病毒核蛋白內生病毒片段與弗蘭德斯病毒(Flanders virus)核蛋白基因序列相關，該病毒至今未在海南島有報道，初步證明了彈狀病毒核蛋白基因是在蚊子擴散到海南島來之前就整合如蚊子基因組中，因此海南蚊子可能跟其他地區(qū)的蚊子來自同一個地域的祖先。

蚊媒病毒包含黃病毒和彈狀病毒，彈狀病毒屬于非逆轉錄病毒。黃病毒內生病毒片段已被證明廣泛存在于蚊子基因組中，但是彈狀病毒內生病毒片段在蚊子基因組中的存在還少有報道[12-13]。分子生物學和基因組學方法揭示了蚊子基因組中同樣也存在大量的彈狀病毒內生病毒片段，這些內生病毒片段主要來源于彈狀病毒核蛋白、聚合酶和糖蛋白G基因[14]。在千萬年的歷史進化中博爾納病毒(BDV)的核蛋白內生病毒片段表現(xiàn)出高度保守；雖然對博爾納病毒(BDV)的核蛋白內生病毒片段的整合機制還不是很清楚，但分析可以表明，存在于哺乳動物基因組中的博爾納病毒(BDV)的核蛋白內生病毒片段比存在于哺乳動物基因組中的非逆轉錄病毒的內生病毒片段還要早[10-17]。來源于逆轉錄或非逆轉錄病毒內生病毒片段在哺乳動物基因組中的大量存在，促使我們對蚊子基因組中彈狀病毒核蛋白內生病毒片段的研究。實驗證明來源于海南島蚊子基因組中的彈狀病毒核蛋白內生病毒片段在地域上是高度保守，這進一步表明病毒核蛋白基因在進化中是高度保守的，因此病毒核蛋白基因可以作為分子化石用來研究病毒與哺乳動物進化上的相關信息。

按蚊、庫蚊和伊蚊是海南島的三種主要蚊種，用這三種蚊子基因組作為模板研究內生病毒片段具有代表性意義。我們認為海南島蚊子基因組中含有很多種內生病毒片段，是一個內生病毒片段的自然基因庫?？衫玫男蛄行畔⒌娜狈筒煌晟剖茄芯课米踊蚪M內生病毒片段的一大障礙。研究一些最近發(fā)生的或是不穩(wěn)定的內生病毒片段需要蚊子個體水平的基因序列。要想進一步研究蚊子基因組內生病毒片段，需要更多的樣本和更多可利用的蚊子基因序列信息。

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Identification and characterization Rhabdovirus nucleoprotein-like endogenous viral elements in the genomes of Aedes and Culex mosquitoes in Hainan island.

CAI Qun-Fang1,LI Shu-Qin2,HUANG Yong-Hao3.1.School ofTropical and Laboratory Medicine,Hainan Medical University,Haikou 571199,Hainan,CHINA;2.Nongken High School of Hainan Province,Haikou 570226,Hainan,CHINA;3.Hainan Provincial Key Laboratory of Tropical Disease,Haikou 571199,Hainan,CHINA

ObjectiveTo identify and characterize rhabdovirus nucleoprotein(NP)-like endogenous viral elements(EVEs)in the genomes of mosquitoes from Hainan Island.MethodsWild mosquito samples were collected from Hainan Island and their total DNA was isolated from these moquitoes as a template for amplifying Rhabdovirus NP-like EvEs,which were identified and characterized by PCR methods and bioinformatic analysis.ResultsRhabdovirus NP-like EVEs amplified by PCR showed positive in the genomes of Aedes aegypti and Culex quinquefasciatus mosquitoes but negative in Anopheles sinensis mosquitoes.Sequencing analysis revealed that the amplified sequence was homologous to the NP gene of Flanders virus.Rhabdovirus NP-like EVEs contained an intact open reading frame (ORF)and were expressed as mRNA.Phylogenetic analysis showed that rhabdovirus NP-like EVEs derived from mosquitoes grouped into a clade and were closely related to Rabies virus and Drosophila sigma virus.ConclusionsRhabdovirus NP-like EVEs are found to be related to Flanders virus,which has never been isolated in Hainan Island.NP-like EVEs might be integrated into the mosquito genomes prior to its dispersal.

Rhabdoviruses;Nucleoprotein;EVEs;Genomes;Mosquitoes.

R372

A

1003—6350(2012)09—001—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2012.09.001

2012-01-13)

海南醫(yī)學院科研培育基金(編號：HY2010-006)

蔡群芳(1981—)，女，四川省資中縣人，講師，研究方向：臨床生物化學與分子生物學。

*通訊作者：黃用豪。E-mail：hyh1027@21cn.com