常方方，董 吉，溫一陽，周 云△

(1.河南衛(wèi)生職工學院內科2教研室;2.河南省人民醫(yī)院腫瘤科，河南 鄭州 450003)

DDP、OXA、5-FU是臨床胃癌化療方案中的常用藥物，DDP+5-Fu方案是胃癌一線基礎治療方案，但一般都是單鉑與5-Fu靜脈聯(lián)用，少有雙鉑與5-Fu靜脈聯(lián)用的報道。鉑類藥物的劑量依賴性毒性和胃癌的藥物多藥耐藥現(xiàn)象，嚴重影響了這類藥物的效果［1］。本研究旨在采取多種實驗方法觀察以DDP、OXA為主聯(lián)合用藥對胃癌細胞的體外抑瘤活性，為開發(fā)高效低毒的臨床化療方案，最大限度地發(fā)揮鉑類藥物療效，提高胃癌治療效果提供科學的實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細胞及試劑 ①胃癌細胞株BGC-823;②藥物：DDP注射液(30 mg/支)購自江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司;OXA注射液(50 mg/支)購自成都世紀華洋制藥有限責任公司;5-FU(250 mg/支)購自上海旭東海普藥業(yè)有限公司。③試劑：四甲基偶氮唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)，均購自美國 Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 藥物濃度設定 根據(jù)預實驗結果，取4個不同的濃度組，：A組(OXA+DDP)劑量1～4分別為：3.125/1.562 5，6.25/3.125，12.5/6.25，25/12.5 ug/ml;B組(OXA+DDP+5-Fu)劑量1～4分別為：3.125/1.5625/15.625，6.25/3.125/31.25，12.5/6.25/62.5，25/12.5/125 ug/ml。

1.2.2 組別設計 設空白對照組、對照組和實驗組?？瞻讓φ战M：無細胞，只加等體積的PBS液，作空白調零孔。對照組：含細胞，只加等體積的培養(yǎng)液。實驗組：含細胞，加入用培養(yǎng)液稀釋的不同濃度A、B組的藥物。

1.2.3 MTT法測定細胞生長抑制率 取對數(shù)生長期細胞常規(guī)消化并制成單細胞懸液，調整細胞濃度為4～5×104，接種于96 孔板中，每孔0.1 ml，培養(yǎng)24 h后，按實驗設計加入藥物，分別設實驗組、對照組和空白對照組，每組設6個平行孔。37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，每孔加入MTT液20 μl，培養(yǎng)4 h，取出培養(yǎng)板，棄去舊的培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 200 μl，微量震蕩器振蕩 10 min，使結晶物充分溶解，用酶聯(lián)免疫檢測儀在570 nm波長下檢測每孔的吸光值(OD)，按下述公式計算細胞生長抑制率：細胞生長抑制率=(1-實驗組平均OD值/對照組平均OD值)×100%。相同藥物設計組重復3板。

1.2.4 繪制生長曲線 根據(jù)不同濃度A、B 2組聯(lián)合用藥作用胃癌細胞48 h的MTT結果繪制生長曲線。

1.3 統(tǒng)計學分析 利用SPSS13.0軟件行單因素方差分析及相關分析，檢驗水準a=0.05。

2 結果

2.1 A、B 2組藥物對胃癌細胞的生長抑制率測定結果 結果顯示：在一定范圍內，A組、B組對胃癌細胞的生長抑制具有濃度依賴性，呈正相關;且同濃度下B組對胃癌細胞的抑制作用較A組顯著增強(F=3 718.51，P ＜0.01)，OXA 和 DDP 的 IC50 值也明顯下降，見表1。

2.2 A、B 2組藥物對胃癌細胞的生長抑制曲線圖從圖上看，在相同濃度下，對細胞生長的抑制作用B組明顯高于A組，如：在劑量1下，OXA聯(lián)合順鉑對胃癌的抑制率為39.10%，而OXA、DDP和5-Fu聯(lián)合對胃癌細胞的抑制作用提高到56.90%，見圖1。

表1 2組細胞體外生長抑制率比較(±s，n=24)

表1 2組細胞體外生長抑制率比較(±s，n=24)

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劑量 1 0.47 ±0.05 56.90劑量 2 0.39 ±0.04 64.20劑量 3 0.25 ±0.04 77.10劑量4 0.16 ±0.03 85.30

3 討論

鉑類是細胞周期非特異性抗癌藥物，順鉑和奧沙利鉑對胃癌的治療作用已經(jīng)取得了共識，兩者作用機制相似，都是通過與DNA鏈結合形成交叉鏈，抑制DNA聚合酶，致使DNA復制、轉錄失敗，造成腫瘤細胞死亡。順鉑、奧沙利鉑藥效作用和毒性作用具有濃度和時間依賴性。5-Fu是胃癌化療的基礎藥物之一，屬于細胞周期特異性藥物，對細胞周期各時相均有作用，以DNA合成期(S)期最佳。DDP、OXA、5-Fu聯(lián)合應用基于以下幾個方面：①符合聯(lián)合用藥的原則(周期非特異性藥物+周期非特異性藥物或周期特異性藥物)。②DDP與OXA有相似的作用機理、不同的劑量限制性毒性，順鉑的劑量限制性毒性為耳腎毒性，奧沙利鉑則是為外周神經(jīng)限制性毒性，兩者合用提高了鉑類總用量而毒性作用不疊加，起到增效減毒的作用;這點作者已通過體外實驗得到了證實［2］，袁洪新等采用DDP與OXA聯(lián)合對體外肝癌細胞株HepG2的研究報道也證實了這一點［3］。③DDP對 5-Fu有生化調節(jié)增效作用［4］，OXA 與5-Fu 有協(xié)同增效作用［5］。

該實驗MTT結果顯示，OXA、DDP及5-Fu 2者或3者聯(lián)合用藥不同濃度下對胃癌細胞的生長抑制作用有顯著差異(P＜0.01)，且隨著藥物濃度的增加而增強。同一時間相同濃度下，3藥聯(lián)合較2藥聯(lián)合對胃癌細胞的生長抑制作用明顯提高，OXA、DDP的IC50值也明顯下降。這表明在固定劑量配比、同時用藥下OXA、DDP與5-Fu聯(lián)合應用表現(xiàn)出明顯的增效作用，但由于細胞凋亡是一個復雜的過程，體外實驗的結果不可能完全與體內結果相符，尚需大量體內外實驗，探討聯(lián)合用藥的方式和毒副作用，以期為臨床提供更為可行的方案。

［1］吳勝春，檀碧波，呂品田，等.胃癌組織鉑類藥物體外化療藥敏性與多種耐藥相關因子表達的關系［J］.廣東醫(yī)藥，2010，31(4)：470-472.

［2］常方方，高 明，周 云.奧沙利鉑聯(lián)合順鉑對體外培養(yǎng)BGC-823細胞增殖、Bcl-2、Bax、Caspase-3 蛋白表達的影響［J］.鄭州大學學報，2009，44(2)：359-362.

［3］袁洪新，于志堅，鄔紅霞.奧沙利鉑聯(lián)合順鉑對肝癌細胞株HepG2抑制作用的研究［J］.山東醫(yī)藥，2008，48(45)：10-12.

［4］Yim EK，Lee SB，Lee KH，Kim CJ，et al.Analysis of the in vitro synergistic effect of 5-fluorouracil and cisplatin on cervical carcinoma cells［J］.Int J Gynecol Cancer.2006，16(3)：1 321-1 329.

［5］Baoli Qin，Risa Tanaka，Yoshihiro Shibata，et al.In-vitro schedule-dependent interaction between oxaliplatin and 5-fluorouracil in human gastric cancer cell lines［J］.Anticancer Drugs，2006，17(4)：445.