史飛濤，秦守杰，孔武明

(焦作市人民醫(yī)院消化內(nèi)科，河南 焦作 454002)

富含半胱氨酸61(cysteine-rich 61，Cry 61)是CCN家族成員，是一種分泌型的細胞外基質(zhì)蛋白，屬即刻早期反應基因產(chǎn)物，具有促進細胞粘附、遷移、增殖及血管生成的功能。近年研究發(fā)現(xiàn)Cyr 61與腫瘤發(fā)生密切相關［1-2］。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是重要的促血管生成因子，在腫瘤血管形成中起重要作用。筆者采用免疫組織化學技術對胃癌患者組織標本進行Cry 61和VEGF檢測，探討Cyr 61和VEGF與胃癌的關系，對兩者的相關性進行分析，從而為胃癌的臨床治療及預后判斷提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料 收集焦作市人民醫(yī)院病理科2009～2010年手術切除的胃癌組織標本70例，其中男49例，女21例，年齡35～76歲，平均62.4歲。所有病例術前均未進行任何抗腫瘤治療，術后均經(jīng)病理檢查確診。另取20例距離腫瘤邊緣不小于5 cm的正常組織作為對照。

1.2 主要試劑 兔抗人Cyr 61多克隆抗體、鼠抗人VEGF單克隆抗體購自Santa Cruze Biotech公司，免疫組化試劑盒及DAB顯色劑購自武漢博士德公司。

1.3 實驗方法 組織經(jīng)甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，做4 μm厚連續(xù)切片，采用免疫組化SABC法檢測Cyr 61、VEGF的表達情況。實驗步驟嚴格按試劑盒說明書操作。石蠟切片脫蠟，以微波枸櫞酸鹽進行抗原修復，抗Cyr 61濃度為1∶200，VEGF抗體工作濃度為1∶100，DAB顯色，蘇木精復染，脫水，透明封片，顯微鏡下觀察，用已知標準的Cyr 61和VEGF表達陽性的胃癌組織切片作為陽性對照;用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替I抗，作為陰性對照。

1.4 結果判定 采用雙盲法，由兩位有經(jīng)驗的病理科醫(yī)師在不知道病理分級和臨床資料的情況下讀片。Cyr 61和VEGF均以胞質(zhì)呈現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。根據(jù)染色陽性細胞占計數(shù)細胞總數(shù)的百分比分為：＜5%為陰性(-)，5% ～25%為弱陽性(+)，25% ～50%為陽性(++)，＞50%為強陽性(+++)，強陽性和陽性為高表達，弱陽性和陰性為低表達。

1.5 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 17.0統(tǒng)計分析軟件包進行統(tǒng)計學處理，計數(shù)資料采用t驗，分類資料采用χ2檢驗和單因素方差分析，Cyr 61和VEGF的相關性用 spearman等級相關分析，檢驗水準 a=0.05。

2 結果

2.1 胃癌組織和癌旁正常胃組織中Cyr 61、VEGF蛋白的表達 20例癌旁正常胃黏膜組織中有6例Cyr 61蛋白染色，表達率為30%;70例胃癌組織中，52例Cyr 61蛋白染色陽性，表達率為74.3%，二者相比，差別有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);而VEGF在癌旁正常胃黏膜組織和胃癌組織中分別有7例和53例陽性，表達率分別為35.0%和75.7%。Cyr 61和VEGF陽性染色主要定位于胃癌癌細胞的胞質(zhì)，細胞核無染色;間質(zhì)細胞散在著色，表達陽性的腫瘤細胞多位于浸潤前沿。

2.2 Cyr 61和VEGF的表達與胃癌臨床病理特征的關系 Cyr 61和VEGF在胃癌組織中的表達與患者年齡、性別、病理類型、腫瘤直徑大小及位置無關(P＞0.05)，Cyr 61與胃癌組織的浸潤深度、淋巴結轉移及Dukes’分期密切相關(P＜0.05)。隨著腫瘤浸潤深度的增加，Cyr 61表達呈上升趨勢，其差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);淋巴結轉移組的Cyr 61陽性表達率顯著高于無淋巴結轉移組的陽性率(P＜0.01);Dukes’C、D 期 Cyr 61 陽性表達率明顯高于A、B期，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。VEGF與胃癌組織的浸潤深度、淋巴結轉移及Dukes’分期也密切相關(P＜0.05)。隨著腫瘤浸潤深度的增加，VEGF表達呈上升趨勢，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);淋巴結轉移組的VEGF陽性表達率顯著高于無淋巴結轉移組(P ＜0.01)，Dukes’C、D 期 VEGF表達明顯高于 A、B期，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，見表1。

表1 Cyr 61和VEGF的表達與胃癌臨床病理特征的關系

2.3 Cyr 61和VEGF表達的相關性 70例胃癌組織中Cyr 61和VEGF表達共陽性者39例，Cyr 61和VEGF表達共陰性者16例，Cyr 61表達陽性而VEGF表達陰性者11例，Cyr 61表達陰性而VEGF表達陽性者14例，表達一致率為78.6%(55/70)，Spearman等級相關分析表明二者之間表達呈正相關(P ＜0.05)。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，在不同的組織細胞及腫瘤中，Cyr 61的表達水平不同，其功能也不相同。Cyr 61在乳腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、骨肉瘤中高表達，促進腫瘤細胞的增殖和腫瘤組織血管形成［3-4］，但Cyr 61在前列腺癌、非小細胞肺癌、子宮內(nèi)膜癌、子宮平滑肌瘤中低表達，起到類似抑癌基因的作用［3-6］。Lin等用免疫組織化學染色方法檢測Cyr 61在胃癌的表達水平，結果發(fā)現(xiàn)Cyr 61的表達與淋巴結轉移及腫瘤分期相關;Cyr 61高表達組的5 a無病生存率低于低表達組，且更易早期復發(fā)［7］。Hong等研究發(fā)現(xiàn)，Cyr 61在非家族性腺瘤性息肉病或非其他遺傳性的早期結直腸癌黏膜內(nèi)的表達水平較正常對照組明顯上調(diào)，且互相獨立表達［8］，表明黏膜內(nèi)Cyr 61等基因的表達上調(diào)可能預示了早期結直腸癌的發(fā)生。該研究發(fā)現(xiàn)，Cyr 61在胃癌組織中呈高表達，明顯高于癌旁正常黏膜組織，同時發(fā)現(xiàn)，Cyr 61蛋白的表達與胃癌的浸潤深度、淋巴結轉移及Dukes’分期呈正相關，這與Lin等的研究結果一致［9］。

大量研究證明，血管生成是腫瘤生長、侵襲、轉移的基本要素，新生血管的形成在腫瘤發(fā)生、發(fā)展的過程中起重要作用。VEGF是促進血管生成的重要因子，是一種具有肝素結合性的同源二聚體糖蛋白，由多種細胞分泌，以旁分泌的方式通過酪氨酸激酶受體特異性地作用于內(nèi)皮細胞，對內(nèi)皮細胞產(chǎn)生促分裂、增生和趨化作用，并能增強血管通透性，有利于血漿、纖維蛋白外滲，促進血管形成［9］。

VEGF與胃癌的浸潤深度、淋巴結轉移及臨床分期也存在相關性。目前，大多數(shù)研究認為MVD(multivessel coronary artery disease)值高是腫瘤預后不佳的指標。張宏圖等研究也發(fā)現(xiàn)胃癌患者血清VEGF濃度高于健康對照者，與胃癌浸潤深度、淋巴結轉移、遠處轉移、腫瘤分期密切相關［11］。本研究結果表明VEGF的表達與患者年齡、性別、病理類型、腫瘤直徑大小及位置無關(P＞0.05)，VEGF與胃癌組織的浸潤深度、淋巴結轉移及Dukes’分期密切相關(P＜0.05)。隨著胃癌浸潤深度的加深、淋巴結的轉移和臨床病理分期的增加，VEGF陽性表達率增加，因此認為VEGF與腫瘤惡性程度呈正相關，可以作為評價胃癌增殖、判斷腫瘤侵襲力的重要標志。

Cyr 61表達陽性率高的胃癌組織切片中，VEGF表達陽性率也增高，表達一致率為78.6%(55/70)，并且表達部位基本一致，提示在胃癌組織中，Cyr 61可能上調(diào)VEGF的表達參與腫瘤血管的生成，結果顯示Cyr 61作為胃癌惡性指標在臨床上有一定價值;同時提示腫瘤細胞可能通過調(diào)節(jié)Cyr 61蛋白表達水平對下游VEGF的表達進行調(diào)控，以促進腫瘤血管的生成。臨床上聯(lián)合檢測Cyr 61、VEGF的表達可能有助于判斷胃癌的預后。

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［4］Tong X，O’Kelly J，Xie D，et al.Cyr 61 suppresses the growth of non-small-cell lung cancer cells via the beta-catenin-c-myc-p53 pathway［J］.Oncogene，2004，23(28) ：4 847-4 855.

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［10］Ferrara N.Vascular endothelial growth factor：basic science and clinical progress［J］.Endocr Rev，2004，25(4)：581-611.

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