謝淑佩，段炤，陳媛媛，梁昌達(dá)

（江西省兒童醫(yī)院血液科，江西南昌330006）

TEL-AML1融合基因的表達(dá)與兒童急性淋巴細(xì)胞白血病的療效及預(yù)后相關(guān)性研究

謝淑佩，段炤，陳媛媛，梁昌達(dá)

（江西省兒童醫(yī)院血液科，江西南昌330006）

目的研究TEL-AML1融合基因在兒童急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL）中的表達(dá)情況，探討該融合基因?qū)ζ浏熜Ъ邦A(yù)后的影響。方法選取200例ALL患兒作為研究對(duì)象，分析TEL/AML1、E2A/PBX1、m-BCR/ ABL、AF4/MLL四種融合基因的表達(dá)情況，并分為TEL/AML1+組（44例）與TEL/AML1-組（135例），比較兩組患兒細(xì)胞抗原、年齡、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、誘導(dǎo)化療緩解、病死率及中樞侵犯等情況。結(jié)果TEL/AML1+表達(dá)均為B細(xì)胞系，共計(jì)44例，占22.0%，14例E2A/PBX1陽(yáng)性（7.0%），5例AF4/MLL陽(yáng)性（2.5%），2例m-BCR/ABL陽(yáng)性（1.0%）。TEL-AML+組患兒CD13與CD20的表達(dá)與TEL-AML-組患兒存在顯著性差異（P＜0.05），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其他抗原表達(dá)未見與陰性組有顯著差異。TEL-AML1+組患兒與TEL-AML1-組患兒比較，白細(xì)胞計(jì)數(shù)低于20×109/L，短期治療達(dá)CR比例更高，而死亡率及中樞神經(jīng)侵犯比例更低，提示TEL-AML1+組患兒危險(xiǎn)程度明顯低于陰性組。結(jié)論TEL/AML1融合基因在兒童急性淋巴細(xì)胞型白血病中較為常見，尤其是B細(xì)胞性ALL，其陽(yáng)性表達(dá)是預(yù)后較好的標(biāo)志之一。

TEL-AML1融合基因；兒童；急性淋巴細(xì)胞型白血??；

目前發(fā)現(xiàn)細(xì)胞遺傳學(xué)的改變?cè)诩毙园籽?Acute leukemia，AL)發(fā)生中具有重要的作用，可增加造血細(xì)胞的自我更新及增殖能力，改變細(xì)胞的分化機(jī)制，引起造血干細(xì)胞或定向祖細(xì)胞向白血病細(xì)胞轉(zhuǎn)化。較為常見的細(xì)胞遺傳學(xué)異常包括染色體易位、染色體數(shù)目改變和原癌基因異常表達(dá)[1-2]。TEL-AML1融合基因在兒童急性淋巴細(xì)胞白血病(Acute lymphoblastic leukemia，ALL)較為常見。本次研究收集兒童ALL患兒的骨髓細(xì)胞標(biāo)本，分析TEL-AML1融合基因在兒童急性淋巴細(xì)胞白血病中的表達(dá)及其與臨床療效的相關(guān)性，為評(píng)估ALL患兒的治療反應(yīng)和預(yù)后、預(yù)防復(fù)發(fā)提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2007年1月至2011年12月我科收治的200例ALL患兒作為研究對(duì)象，所有研究標(biāo)本來源于我院診斷為ALL患兒的骨髓細(xì)胞，均符合MICM型診斷標(biāo)準(zhǔn)。其中男性124例，女性76例，年齡范圍4個(gè)月～12歲，中位年齡4.6歲，初發(fā)時(shí)外周血WBC(1.1～398.0)×109/L。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn)1）年齡＜14歲；2）于我院經(jīng)骨髓檢查確診為ALL的初診患兒；3）復(fù)發(fā)的ALL患兒近4周內(nèi)未用過激素及化療。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn)1）入院前4周內(nèi)已給予激素或化療的患兒；2）患兒及家屬不配合者；3）患兒存在其他自身免疫性疾病和遺傳性家族史。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法收集患兒入院當(dāng)天的年齡、性別；初診時(shí)外周血的白細(xì)胞數(shù)、幼稚細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)及生化指標(biāo)，所有操作均由我院檢驗(yàn)科常規(guī)完成；骨髓的原始和幼稚淋巴細(xì)胞比例、細(xì)胞FAB形學(xué)分類測(cè)定；流式細(xì)胞儀測(cè)定骨髓白血病細(xì)胞的免疫表型（流式細(xì)胞儀型號(hào)：BDFACSCantoII，產(chǎn)地：美國(guó)）。

1.3.1 標(biāo)本采集和骨髓細(xì)胞分離于初診未化療前采集骨髓標(biāo)本，按體積2：1將骨髓標(biāo)本沿管壁加入淋巴細(xì)胞分離液，2 000 r/min離心15 min，吸取中間單個(gè)核細(xì)胞層，加RPMIL 1640或pH 7.2磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗，2 000 r/min離心5 min，取細(xì)胞沉淀物，計(jì)數(shù)細(xì)胞調(diào)整至1.0×107/ml。

1.3.2 RNA抽提1×107個(gè)單核細(xì)胞以1 ml的TRlzol試劑打勻，加0.2 ml氯仿，顛倒混勻，用力振蕩15 s，室溫放置2～3 min，4℃12 000 r/min 30 min，吸取無色透明上清液約0.5 ml，加異丙醇0.5 ml，室溫放置5～10 min，4℃12 000 r/min 15 min，棄上清，倒放在濾紙上吸干水分，用70%，100%酒精各清洗RNA沉淀一次，4℃12 000 r/min，棄上清，空氣干燥RNA，加適量DEPC水溶解RNA。用紫外分光光度計(jì)測(cè)定A260值。

1.3.3 逆轉(zhuǎn)錄(RT)反應(yīng)樣品RNA20 μg，加6'隨機(jī)引物1 μl，DEPC水補(bǔ)足至20 μl，70℃變性5 min，4℃保存。再在每管中加入5×RT buffer 8.0 μl，0.1 mol/L DTT 4 μl，10 mmol/L dNTPs 2.0 μl，100 U/μl RNAsin 1.0 μl，200 U/μ1M-MLV 1.0 μl，DEPC水4.0 μl，逆轉(zhuǎn)錄體系總量為40 μl。37℃反應(yīng)60 min，95℃滅活5 min，4℃保存。嚴(yán)格按照試劑盒要求操作，采用巢式PCR反應(yīng)檢測(cè)TEL-AML1融合基因，并根據(jù)其是否表達(dá)分為TEL/AML1+組與TEL/AML1-組。

1.4 研究方法將融合基因TEL/AML1表達(dá)陽(yáng)性的患兒納入TEL/AML1+組，未檢測(cè)到其他異常融合基因的患兒納入TEL/AML1-組，比較兩組患兒細(xì)胞抗原、年齡、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、誘導(dǎo)化療緩解、病死率及中樞侵犯等情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1200 例患兒融合基因陽(yáng)性病例的免疫分型分布TEL/AML1+表達(dá)均為B細(xì)胞系，共計(jì)44例，占22.0%，E2A/PPBX1表達(dá)的患兒14例，占7.0%；BCR/ABL表達(dá)患兒2例，占1.0%；AF4/Mll表達(dá)5例，占2.5%。按照TEL-AML1表達(dá)進(jìn)行分組，TEL-AML+組44例，135例未檢測(cè)到其他異常融合基因的患兒納入TEL-AML-組，失訪5例，見表1。

2.2 TEL-AML+組與TEL-AML-組患兒不同細(xì)胞表面抗原的表達(dá)經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)，TEL-AML+組患兒CD13與CD20的表達(dá)與TEL-AML-組患兒存在顯著性差異（P＜0.05），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其他抗原表達(dá)未見與陰性組有顯著差異，見表2。

2.3 TEL-AML1基因與患兒臨床特征及療效的關(guān)系TEL-AML1+組患兒與TEL-AML1-組患兒比較，白細(xì)胞計(jì)數(shù)低于20×109/L，短期治療達(dá)CR比例更高，而死亡率及中樞神經(jīng)侵犯比例更低，提示TEL-AML1+組患兒危險(xiǎn)程度明顯低于TEL-AML1-組，見表3。

表1 200例患兒融合基因陽(yáng)性病例的免疫分型分布[例（%）]

表2 TEL-AML+與TEL-AML-患兒不同細(xì)胞表面抗原的表達(dá)[例（%）]

表3 TEL-AML+與TEL-AML-患兒臨床特征及療效的比較[例（%）]

3 討論

本次研究中列入200例急性淋巴細(xì)胞白血病的患兒，共有65例出現(xiàn)染色體易位融合基因，最為常見的為TEL-AML1，占22%，另外還有EA/PBX1、BCR-ABL和MLL-AF4等，與其他報(bào)道相符[3-4]。有學(xué)者[5]研究發(fā)現(xiàn)，急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)約占兒童白血病的75%，以12p13上的TEL(Translocation ets leukemia)基因與21q22上的AML1(Acutemyeloid leukemia 1)基因融合更為多見，占B系急性淋巴細(xì)胞白血病患兒的16%～36%。

TEL基因?qū)儆贓TS轉(zhuǎn)錄因子家族，其功能為調(diào)節(jié)細(xì)胞分化和增殖相關(guān)的靶基因轉(zhuǎn)錄水平。TEL經(jīng)二聚體化和SUMO-1修飾后才有正常的功能，TEL基因在各組織細(xì)胞中均廣泛表達(dá)，但血液系統(tǒng)的細(xì)胞中相對(duì)高表達(dá)，對(duì)骨髓中所有細(xì)胞譜系的建立起關(guān)鍵作用，特別是造血祖細(xì)胞歸巢到骨髓的過程中具有重要作用[6-7]。AML1是核心結(jié)合因子CBF(Core binding factor)的亞基，與CBFβ二聚體化后在造血過程中起重要的作用[8]，AML1核心結(jié)合因子啟動(dòng)HOX基因并調(diào)節(jié)下游的轉(zhuǎn)錄過程，在調(diào)節(jié)造血細(xì)胞的發(fā)育中具有重要意義。AML1基因?qū)撬柙煅?xì)胞系的正常發(fā)育是必需的，因此AML1的功能受損可影響骨髓的細(xì)胞增殖和分化過程[9]。

通過比較分析，我們發(fā)現(xiàn)兒童B系A(chǔ)LL以TEL-AML1+融合更為多見，其免疫表型也具有一定的特點(diǎn)：以前B系和普通B淋巴細(xì)胞表型為主，早前B和成熟B淋巴細(xì)胞的表型極為少見；另外，細(xì)胞表面抗原的比較發(fā)現(xiàn)，TEL-AML1+組患兒的CD13表達(dá)更高，而CD20表達(dá)率更低。有學(xué)者認(rèn)為在高危、復(fù)發(fā)和誘導(dǎo)緩解后的兒童ALL患者中可檢測(cè)出微小殘留病灶中CD20抗原表達(dá)上調(diào)[10]。左英熹等[11]研究發(fā)現(xiàn)，TEL-AML1+患兒伴有髓系CD13、CD33抗原高水平表達(dá)及CD20的低水平表達(dá)。

我們同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，TEL-AML1+的ALL患兒CD10、HLA-DR的高水平表達(dá)。CD10是一種Ⅱ型結(jié)構(gòu)膜蛋白，一般在早期的淋巴前體細(xì)胞、生發(fā)中心被激活的B細(xì)胞中表達(dá)；HLA-DR分子見于B淋巴細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞等，參與免疫活性細(xì)胞間的互相作用，有學(xué)者認(rèn)為這兩個(gè)抗原可作為TEL-AML1+的ALL患兒微小殘留病(MRD)的檢測(cè)指標(biāo)。

本次研究發(fā)現(xiàn)TEL-AML1+組的ALL患兒預(yù)后較好，其死亡率及中樞神經(jīng)系統(tǒng)侵犯均顯著低于TEL-AML1-組患兒。我們認(rèn)為，TEL-AML1+組患兒外周血白細(xì)胞總數(shù)及幼稚細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)顯著低于TEL-AML1-組ALL患兒，表明TEL-AML1+組患兒體內(nèi)腫瘤負(fù)荷較低，短期內(nèi)達(dá)CR的比例更高。有學(xué)者認(rèn)為TEL-AML1+的ALL患兒對(duì)左旋門冬酰胺酶的敏感度更高，對(duì)化療敏感、治療短期內(nèi)即可獲得完全緩解，而且CR時(shí)間更長(zhǎng)，短期內(nèi)復(fù)發(fā)率低，平均復(fù)發(fā)時(shí)間為獲得CR的2年后，而且復(fù)發(fā)后仍然對(duì)化療藥物敏感，可獲得二次緩解[12]。因此，我們認(rèn)為TEL-AML1基因融合可作為ALL患兒預(yù)后判斷的指標(biāo)之一。

[1]GaoYJ，ZhuXH,YangY,et al.Prevalence of ETV6-RUNX1 fusion gene in children with acute lymphoblastic leukemia in China[J]. Cancer GenetCytogenet,2007,178(1)：57-60.

[2]巫翠萍,覃西,趙蓮,等.47例急性淋巴細(xì)胞白血病免疫表型分析[J].海南醫(yī)學(xué),2010,21(22)：62-64.

[3]高超,李志剛,趙瑋,等．兒童急性淋巴細(xì)胞白血病e2a-pbx1融合基因的表達(dá)水平與臨床特點(diǎn)、早期治療反應(yīng)的相關(guān)性[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志,2008,16(3)：569-573.

[4]Shiozawa Y,Pedersen EA,Taichman RS.GAS6/Mer axis regulates the homing and survival of the E2A/PBX1-positive B-cell precursor acte lymphoblastic leukemia in the bone marrow niche[J]. Exp Hematol,2010,38(2)：132-140.

[5]Zaliova M,Madzo J,Cario G,et al.Revealing the role of TEL/ AML1 for leukemic cell survival by RNAi-mediated silencing[J]. Leukemia,2011,25(2)：313-320.

[6]Zuna J,Madzo J,Krejci O,et al.ETV6/RUNX1(TEL/AML1)is a frequent prenatal first hit in childhood leukemia[J].Blood,2011, 117(1)：368-369.

[7]Peter A,Heiden T,Taube T,et al.Interphase FISH on TEL/ AML1-positive patients treated on Dana-Farber Cancer Institute Consortium Protocol95-01[J].Blood,2006,107(11)：4508-4513.

[8]韓潔,朱曉華,高怡瑾,等.急性淋巴細(xì)胞白血病患兒TEL-AML1融合基因表達(dá)的意義[J].實(shí)用兒科臨床雜志,2007,22 (3)：191-194.

[9]郭霞,李強(qiáng).TEL-AML1融合基因與兒童急性淋巴細(xì)胞白血病[J].實(shí)用兒科臨床雜志,2007,22(3)：227-235.

[10]何云燕,羅建明,蔣玉鳳.兒童B系急性淋巴細(xì)胞白血病CD20表達(dá)及臨床意義[J].重慶醫(yī)學(xué),2011,40(23)：2327-2329.

[11]左英熹,張樂萍,陸愛東,等.具有不同融合基因的B系急性淋巴細(xì)胞白血病患兒的臨床特征分析[J].中國(guó)當(dāng)代兒科雜志,2010,12 (3)：172-176.

[12]李志剛,趙瑋,高超,等.兒童急性淋巴細(xì)胞白血病TEL-AML1融合基因的表達(dá)水平與臨床特點(diǎn)、早期治療反應(yīng)的關(guān)系[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志,2007,15(3)：523-527.

Expression of TEL-AML1 fusion gene in children with acute lymphoblastic leukemia and its effect on the clinical efficacy and prognosis.

XIE Shu-pei,DUAN Zhao,CHEN Yuan-yuan,LIANG Chang-da.Department ofHematology,Children's Hospital of Jiangxi Province,Nanchang 330006,Jiangxi,CHINA

ObjectiveTo study the expression of TEL-AML1 fusion gene in children with acute lymphoblastic leukemia(ALL),and its effect on the clinical efficacy and prognosis.MethodsReverse transcription and polymerase chain reaction was applied to detect the expression of four fusion genes(TEL/AML1,E2A/PBX1,BCR/ABL and AF4/MLL)in 200 children with ALL.Based on the expression of TEL/AML1,the patients were divided into two groups：TEL/AML1+group and TEL/AML1-group.Comparison was made in terms of the immunological characteristics,age,white cell count,prognosis between two groups.ResultsOf the 200 children,44(22.0%)were TEL-AML1 positive,14(7.0%)were E2A/PBX1 positive,5(2.5%)were AF4/MLL positive,and 2(1.0%)were m-BCR/ABL positive.In TEL-AML1+group,the positive rate of CD13was significantly higher than that in TEL-AML1-group(P＜0.05),while the positive rate of CD20was significantly lower(P＜0.05).Besides,TEL/AML1+ group has better prognosis in terms of high complete remission rate and low white cell count.ConclusionTEL/ AML1 fusion gene is the most common molecular aberration in childhood ALL,especially in B cell lymphoblastic leukemia,and positive patients show better prognosis.

TEL-AML1 fusion gene;Children;Acute lymphoblastic leukemia

R725.5

A

1003—6350（2012）22—004—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2012.22.002

2012-08-30)

江西省衛(wèi)生廳普通科技計(jì)劃（編號(hào)：20123143）

謝淑佩（1978—），女，江西省南昌市人，主治醫(yī)師，本科。