吳紅專，朱燦陽，劉俊

(海南省人民醫(yī)院藥學(xué)部，海南?？?70311）

·實(shí)驗(yàn)研究·

賴諾普利對大鼠膽汁淤積性肝硬化的抗肝纖維化作用

吳紅專，朱燦陽，劉俊

(海南省人民醫(yī)院藥學(xué)部，海南?？?70311）

目的探討賴諾普利對膽汁淤積性肝硬化的抗肝纖維化作用。方法采用膽總管結(jié)扎術(shù)制備大鼠膽汁淤積性肝硬化模型，分為賴諾普利組和模型對照組。前者于術(shù)后第3周給藥，具體為：賴諾普利0.1 mg/kg灌胃，1次/d，連續(xù)4周；后者于術(shù)后第3周給予生理鹽水10 ml/kg灌胃，1次/d，連續(xù)4周。同期設(shè)假手術(shù)組作為空白對照。6周后處死大鼠，取三組實(shí)驗(yàn)大鼠肝組織進(jìn)行常規(guī)病理染色和膠原纖維染色；用放射免疫法測定各組血清透明質(zhì)酸酶(HA)和層粘連蛋白(LN)含量，并測定肝組織羥脯氨酸(HYP）含量。結(jié)果與空白對照組比較，賴諾普利組和模型對照組的血清HA、LN活性均下降，而肝組織HYP含量均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與模型對照組比較，賴諾普利組肝細(xì)胞損傷和肝纖維化程度較輕。賴諾普利組的血清HA、LN活性以及肝組織HYP含量分別為(62.1±2.23)ng/ml、(42.8±6.23)ng/ml和(1.6±0.15)μg/mg，明顯低于模型對照組的(97.5±4.50)ng/ml、(66.5±7.32）ng/ml和(2.0±0.27）μg/mg(P＜0.05）。結(jié)論賴諾普利可以有效改善膽汁淤積性肝硬化大鼠模型的肝纖維化程度。

肝硬化；膽汁淤積；肝纖維化；賴諾普利

肝纖維化是慢性肝病重要的病理特征，也是慢性肝炎發(fā)展至肝硬化的必經(jīng)階段，但迄今為止，尚缺乏能夠有效治療肝纖維化的藥物。目前認(rèn)為，肝纖維化的發(fā)生機(jī)制主要是肝星狀細(xì)胞的活化以及細(xì)胞外基質(zhì)的合成與降解失衡導(dǎo)致其在細(xì)胞間質(zhì)過度沉積所致。有研究表明，血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI)與緊張素Ⅱ(AT-Ⅱ)受體阻斷劑均可以抑制肝纖維化[1-2]，但相關(guān)的研究報(bào)道較少。本研究于2011年5～10月建立膽汁淤積性肝硬化動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停荚谔接慉CEI藥物賴諾普利在膽汁淤積性肝硬化大鼠模型中的抗肝纖維化作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物14周齡Wistar大鼠30只，雌雄不分，體重(202±18)g，由海南省藥品檢驗(yàn)所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 藥品與試劑賴諾普利10 mg/片，為捷利康有限公司產(chǎn)品；層粘蛋白(LN)放射兔疫分析測定盒、透明質(zhì)酸(HA)放射免疫分析測定盒均為北京科美東雅生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；羥脯氨酸(HYP)為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組參照文獻(xiàn)[3]將30只SD大鼠隨機(jī)分為三組：空白對照組、模型對照組和賴諾普利組，各10只。模型對照組及賴諾普利組均實(shí)施膽總管結(jié)扎術(shù)，具體為：固定SD大鼠，用戊巴比妥鈉(45 mg/kg)麻醉，正中切口進(jìn)腹，暴露膽總管，用絲線結(jié)扎橫斷膽總管，關(guān)腹?？瞻讓φ战M開腹后僅游離膽總管不予結(jié)扎，關(guān)腹。三組SD大鼠術(shù)后1～3 d肌注青霉素，2次/d，2.5 WU/次。術(shù)后第3周模型對照組和賴諾普利組分別開始給藥，模型對照組：生理鹽水10 ml/kg灌胃，1次/d，連續(xù)4周；賴諾普利組：賴諾普利0.1 mg/kg灌胃，1次/d，連續(xù)4周。

1.4 檢測指標(biāo)及評價(jià)末次給藥24 h取SD大鼠血清4 ml檢測HA和LN含量。處死SD大鼠后在右肝最厚處切取1.0 cm×0.8 cm左右的肝組織2塊，1塊按照常規(guī)病理制作石蠟切片，切片厚4 μm，采用常規(guī)病理染色(HE)及膠原纖維染色(Masson)觀察；另1塊制成肝組織勻漿檢測HYP含量。光鏡下觀察大鼠肝組織的肝纖維化程度及肝組織炎癥活動(dòng)度參照文獻(xiàn)[4]制定的肝纖維化程度分級標(biāo)準(zhǔn)：(－)為匯管區(qū)纖維組織無增生，(+)為增生后面積＜肝小葉1/3，(++)為增生后面積占肝小葉1/3～2/3，(+++)為增生后面積＞肝小葉2/3。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用單因素方差或秩和檢驗(yàn)，肝纖維化程度分級數(shù)據(jù)用秩和檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組SD大鼠的大體情況空白對照組大鼠發(fā)育良好，毛發(fā)有光澤，無尾黃、耳黃、毛發(fā)黃、小便發(fā)黃等；模型對照組精神差，活動(dòng)少，出現(xiàn)尾部黃染、耳黃、毛發(fā)黃染等表現(xiàn)；賴諾普利組健康狀態(tài)相對較好，毛色較好，尾部黃染、耳黃、毛發(fā)黃染等不明顯。

2.2 三組SD大鼠的肝組織病理學(xué)檢查大體觀察：與空白對照組比較，模型對照組的肝臟表面呈黃綠色，表面呈桔皮樣，部分表面呈顆粒狀，邊緣變鈍，質(zhì)脆；賴諾普利組的肝臟顏色較紅潤，呈花斑狀，柔軟，表面顆粒較少，未見明顯結(jié)節(jié)。光鏡觀察：空白對照組的肝臟小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞索由中央靜脈呈放射狀向四周排列，肝竇正常，肝竇內(nèi)及匯管區(qū)周圍有少量間質(zhì)細(xì)胞；模型對照組的肝組織結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，肝細(xì)胞呈花環(huán)狀，多數(shù)有管腔，可見大量膠原組織沉積，纖維化增生明顯；賴諾普利組的膽管上皮細(xì)胞增生匯管區(qū)面積擴(kuò)大，增生的膽管上皮細(xì)胞周圍有纖維組織增生，可見肝細(xì)胞部分壞死及炎性細(xì)胞浸潤。按照肝纖維化程度分級標(biāo)準(zhǔn)，賴諾普利組中4只大鼠肝纖維化(+)，6只肝纖維化(++)，無肝纖維化(+++)，肝纖維化程度明顯低于模型對照組，見表1。

表1 三組大鼠肝臟的纖維化程度分級情況（只）

2.3 三組SD大鼠肝組織HYP的比較空白對照組、模型對照組和賴諾普利組的大鼠肝臟HYP分別為(0.8±0.12)μg/mg、(2.0±0.27)μg/mg和(1.6± 0.15)μg/mg；與空白對照組比較，模型對照組和賴諾普利組HYP含量均顯著升高(P＜0.05)；與模型對照組比較，賴諾普利組的HYP含量明顯降低(P＜0.05)。

2.4 三組SD大鼠血清HA、LN的比較與空白對照組比較，模型對照組和賴諾普利組大鼠血清HA、LN含量均顯著升高(P＜0.05)；與模型對照組比較，賴諾普利組的HA、LN含量明顯降低(P＜0.05)，見表2。

表1 三組SD大鼠血清HA、LN的比較（ng/ml）

3 討論

肝纖維化是慢性肝損傷向肝硬化發(fā)展的重要環(huán)節(jié)和必經(jīng)階段，貫穿于肝硬化發(fā)展的整個(gè)過程，然而目前針對肝纖維化本身治療的有效藥物較少，因此積極尋找抗肝纖維化藥物迫在眉睫。從生物化學(xué)角度來看，肝纖維化與肝臟細(xì)胞外基質(zhì)的合成增加密切相關(guān)，因此目前常常通過檢測血清中細(xì)胞外基質(zhì)成分及其代謝產(chǎn)物來判斷肝纖維化，包括HA、LN、Ⅲ型前膠原氨基端肽(PCⅢNP)和Ⅳ型膠原(C-Ⅳ)[5-7]。HYP是膠原蛋白中特有的代謝產(chǎn)物，其在肝臟組織中的含量可以用來衡量肝纖維化的程度[8-9]。賴諾普利是繼卡托普利、依那普利之后第3代含羧基活性型ACEI，能有效抑制AT-Ⅱ生成，可以作為抗肝纖維化的藥物[2]。Wolf等[10]報(bào)道ACEI與AT-Ⅱ受體阻斷劑抑制肝纖維化的機(jī)制包括兩個(gè)方面：一方面抑制AT-Ⅱ?qū)Ω涡菭罴?xì)胞活化后直接促增殖及促細(xì)胞外基質(zhì)分泌效應(yīng)，另一方面可以消除AT-Ⅱ?qū)﹂g質(zhì)纖維母細(xì)胞TGF-β自分泌的正向調(diào)節(jié)作用，從而抑制細(xì)胞外基質(zhì)的合成。

為探討賴諾普利在肝纖維化中的作用，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了膽汁淤積性肝纖維化模型。既往文獻(xiàn)報(bào)道[11-12]，采取膽總管結(jié)扎大鼠模型在2～6周能夠有效建立膽汁淤積性肝纖維化模型，因此本組實(shí)驗(yàn)采用兩周后給藥，直至6周結(jié)束時(shí)通過病理和血清放射免疫法檢測分析賴諾普利對膽管結(jié)扎誘發(fā)大鼠淤膽性肝纖維化的干預(yù)效果。結(jié)果顯示，與模型對照組比較，賴諾普利組大鼠的健康狀態(tài)相對較好，全身黃染不明顯，肝組織中膽管上皮細(xì)胞有增生，周圍伴有纖維組織增生，肝細(xì)胞呈部分壞死及炎性細(xì)胞浸潤；血清放射免疫法檢測HA、LN的活性均有明顯的下降，肝組織HYP含量亦明顯減少。上述結(jié)果提示賴諾普利可降解淤膽性肝纖維化大鼠細(xì)胞外基質(zhì)的合成，膠原沉積減少，明顯降低肝纖維化的程度。

綜上所述，賴諾普利能夠延緩肝纖維化的進(jìn)展以及減輕肝組織的損傷，對大鼠淤膽性肝硬化的肝纖維化有良好的治療作用，其具體的分子生物學(xué)機(jī)制尚需進(jìn)一步探討。

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Inhibitory effects of lisinopril on obstructive cholestasis induced liver fibrosis in mice.

WU Hong-zhuan,ZHU Chan-yang,LIU Jun.Department of Pharmacy,Peolple's Hospital of Hainan Province,Haikou 570311，Hainan，CHINA

ObjectiveTo study the effect of lisinopril on bile duct ligation-induced biliary cholestasis on liver of mice.MethodsThe experimental model mice of hepatic fibrosis was induced by common bile duct ligation,which were divided into model control group and lisinopril group.Three weeks after the operation,lisinopril(0.1 mg/kg)and physiological saline(10 ml/kg)were administrated respectively by intragastric in lisinopril group and model control group,with once a day for 4 consecutive weeks.False operation group was as blank control in the same period.All the mice were sacrificed six weeks later.Liver tissues of the three groups were detected by routine histological staining and collagen fiber staining;serum hyaluronate lyase(HA)and laminin(LN)levels were measured by radioimmunoassay,including liver hydroxyproline(HYP)content.ResultsSerum HA and LN contents in model control group and lisinopril group were decresed and liver HYP content were increased compared with those in blank control group (P＜0.05).Liver cells injury and the degree of liver fibrosis in lisinopril group were lighter compared with those in model group.Serum HA,LN contents and liver HYP content in lisinopril group were(62.1±2.23)ng/ml,(42.8±6.23)ng/ml and(1.6±0.150)μg/mg,significantly lower than those in model group[（97.5±4.50）ng/ml,(66.5±7.32)ng/ml and(2.0± 0.27)μg/mg;all theP＜0.05].ConclusionLisinopril has effect on preventing hepatic fibrosis in mice model with bile duct ligation-induced biliary cholestasis.

Cirrhosis;Cholestasis;Liver fibrosis;Lisinopril

R-332

A

1003—6350(2012）18—015—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2012.18.006

2012-04-01)

吳紅專（1973—），女，海南省海口市人，主管藥師，本科。E-mail：whz04111@126.com