柳文菊，杜昆

（長(zhǎng)江大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北荊州434000）

監(jiān)測(cè)血漿EBV-DNA含量在鼻咽癌診療中的意義

柳文菊，杜昆

（長(zhǎng)江大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北荊州434000）

目的探討鼻咽癌患者放化療過程中血漿EBV-DNA含量在臨床診療中的意義。方法采用熒光定量PCR法檢測(cè)50例NPC患者在不同的診療階段血漿EBV-DNA的含量，同時(shí)設(shè)50例健康體檢者為陰性對(duì)照組。結(jié)果50例NPC組中EBV-DNA檢測(cè)陽(yáng)性率為92.0%（46/50），健康對(duì)照組陽(yáng)性率為8.0%（4/50）；46例EBV-DNA陽(yáng)性的患者中，26例患者從第一周治療開始，DNA水平就開始明顯下降，至治療結(jié)束前已檢測(cè)不到DNA的復(fù)制；14例患者開始幾周DNA水平變化并不明顯，至治療結(jié)束前，基本檢測(cè)不到DNA的復(fù)制；6例患者在治療過程中均可檢測(cè)到較高水平的EBV-DNA。結(jié)論采用熒光定量PCR方法檢測(cè)NPC患者血漿中游離的EBV-DNA是一種敏感可靠的方法，對(duì)于NPC的早期診斷及預(yù)后具有非常重要的臨床意義。

熒光定量PCR；鼻咽癌；EBV-DNA；血漿

EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)是一種普遍存在的皰疹病毒群，感染后能累及機(jī)體全身各個(gè)器官系統(tǒng)[1-2]，其中以侵犯造血系統(tǒng)和淋巴系統(tǒng)最為常見，可引起各種惡性腫瘤，從而嚴(yán)重危害人類生命健康。鼻咽癌（Nasopharyngeal carcinoma，NPC）是我國(guó)南方常見的一種惡性腫瘤，其具體的發(fā)病機(jī)制仍然不清楚，但目前認(rèn)為NPC的發(fā)生與EBV感染有關(guān)[3-4]。自Mutirangura等[5]報(bào)道NPC患者血漿中可檢測(cè)到EBV-DNA以來，許多學(xué)者都進(jìn)行了這方面的研究，并證實(shí)NPC患者血漿EBV-DNA量的含量能夠反映體內(nèi)腫瘤負(fù)荷情況[6-7]。我們采用TaqMan探針熒光定量PCR技術(shù)對(duì)50例已確診為鼻咽癌的患者血漿EBV-DNA進(jìn)行定量檢測(cè)，探討鼻咽癌患者放化療過程中血漿EBV-DNA含量在臨床診療中的意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料2009年1月至2011年2月間入住我院腫瘤分院經(jīng)初診確診為鼻咽癌的患者50例。年齡27～65歲，平均47.6歲。其中男性38例，女性12例。所有的患者均接受同期放化療。放射治療按照臨床檢查和CT/MRI示腫瘤范圍設(shè)野，并按臨床常規(guī)進(jìn)行?；熍c放療同時(shí)進(jìn)行，采用草酸鉑70 mg/m2每周一次連續(xù)6周。放化療期間，每周用間接鼻咽鏡檢查鼻咽腫物1～2次，同時(shí)密切注意頸淋巴結(jié)腫脹的消退情況。治療結(jié)束后2～3個(gè)月復(fù)查鼻咽CT或MRI、胸片、腹部B超等以評(píng)價(jià)療效。療效的評(píng)價(jià)依據(jù)WHO實(shí)體瘤評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。另采集50例健康體檢者血樣（由體檢中心負(fù)責(zé)抽?。┳鳛殛幮詫?duì)照組。兩組之間性別、年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 血漿標(biāo)本的采取每位受檢者每次抽取血外周血3 ml，加入到EDTA抗凝管中，2 000 rpm離心5 min，吸取200 ul血漿于-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 EBV-DNA的提取及擴(kuò)增將凍存的血漿復(fù)融后放置至室溫，嚴(yán)格按照中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司提供的EBV熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行DNA的提取。吸取抽提的DNA入PCR的反應(yīng)管中，在德國(guó)產(chǎn)Agilent Technologies Stratagene Mx3000P全自動(dòng)擴(kuò)增儀上擴(kuò)增。擴(kuò)增程序如下：93℃3 min，再93℃45 s、55℃2 min，共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后結(jié)果由計(jì)算機(jī)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，以IU/ml報(bào)告，小于檢測(cè)下限5.0×102IU/ml結(jié)果判定為陰性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用方差分析，非正態(tài)分布的計(jì)量資料采用秩和檢驗(yàn)。兩組間EBV-DNA陽(yáng)性率比較采用卡方檢驗(yàn)，P＜0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 鼻咽癌組和健康對(duì)照組血漿EBV-DNA陽(yáng)性檢出率結(jié)果如表1所示，50例鼻咽癌患者中共檢出46例EBV-DNA陽(yáng)性患者，而50例健康對(duì)照組中檢出4例EBV-DNA陽(yáng)性，兩組統(tǒng)計(jì)學(xué)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.2 放化療后不同時(shí)期血漿EBV-DNA水平46例EBV-DNA陽(yáng)性鼻咽癌患者在治療后不同時(shí)期檢測(cè)血漿EBV-DNA含量，發(fā)現(xiàn)40例在治療后EBV-DNA含量逐漸減少，至第6周完全檢測(cè)不到EBV-DNA；另外6例在治療過程中均能檢測(cè)到EBV-DNA。

表2 46例EBV-DNA陽(yáng)性患者治療期間血漿EBV-DNA水平(IU/ml)

2.3 血漿EBV-DNA動(dòng)態(tài)變化與療效的關(guān)系治療前，92%（46/50）的患者血漿中可檢測(cè)到較高水平的EBV-DNA，8%（4/50）患者未檢測(cè)出EBV-DNA。46例EBV-DNA陽(yáng)性的患者中，26例患者從第一周治療開始，DNA水平就開始呈明顯下降，到第4周至第5周，就基本已經(jīng)檢測(cè)不到DNA的復(fù)制。14例患者開始幾周DNA水平變化并不明顯，但到治療結(jié)束前1～2周，也基本檢測(cè)不到DNA的復(fù)制。對(duì)這40例患者在治療結(jié)束后進(jìn)行一系列相關(guān)檢查，確定為完全緩解，而另外6例在治療過程中均能檢測(cè)到EBV-DNA，在治療結(jié)束后進(jìn)行相關(guān)檢查，發(fā)現(xiàn)這6例患者均有腫瘤殘留，其中2例為顱內(nèi)殘留，4例示淋巴結(jié)殘留。

3 討論

長(zhǎng)期以來，檢測(cè)EB病毒相關(guān)抗原抗體如殼抗原IgA抗體(VCA-IgA)、早期抗原IgA抗體(EA-IgA)等是篩查、輔助診斷和監(jiān)測(cè)鼻咽癌病情變化的主要方法[8]。有研究表明VCA-IgA滴度水平在放療中不隨腫瘤的消退而下降，提示抗體檢測(cè)不能精確反映體內(nèi)腫瘤負(fù)荷。由于VCA-IgA半衰期較長(zhǎng)，即使體內(nèi)EB病毒被清除，在較長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)血液中仍可檢出該抗體，故VCA-IgA不能準(zhǔn)確反映鼻咽癌病情變化的情況[9]。

由于鼻咽癌患者血漿或血清中可檢測(cè)出EBV-DNA，本研究通過用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)50例鼻咽癌患者血漿中EBV-DNA水平，46例（92%）陽(yáng)性[中位濃度為（5.23±5）IU/ml]；而在50例對(duì)照組中，僅4例（8%）陽(yáng)性（中位濃度為0 IU/ml），兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。這一結(jié)果與Lo等[10]的研究結(jié)果一致，表明檢測(cè)血漿EBV-DNA是一種敏感有效的初治篩選NPC的方法。

目前，監(jiān)測(cè)NPC患者腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的方法主要依靠常規(guī)體檢、間接鼻咽纖維鏡和影像學(xué)檢查，但這些方法的敏感性和特異性較差、檢測(cè)過程繁瑣、費(fèi)用昂貴、發(fā)現(xiàn)不及時(shí)以及不能明確區(qū)分腫瘤病灶為原發(fā)病灶還是轉(zhuǎn)移病灶等問題。而PCR定量檢測(cè)NPC患者在治療不同階段的血漿EBV-DNA含量，能夠給臨床提供快速和準(zhǔn)確的療效觀察。本研究中，46例EBV-DNA陽(yáng)性患者中，40例患者經(jīng)治療后，血漿中檢測(cè)不到EBV-DNA，同時(shí)其癥狀也得到緩解，腫瘤消退；而另外6例患者，在治療過程中均能檢測(cè)到EBV-DNA，其癥狀緩解不明顯，有腫瘤殘留。這表明NPC患者治療后EBV-DNA的含量能很好的反映患者病情變化，這對(duì)NPC患者的療效及預(yù)后判斷具有非常重要的臨床意義。

綜上所述，采用熒光定量PCR方法檢測(cè)血漿中游離的EBV-DNA，對(duì)于NPC的早期診斷、療效及預(yù)后判斷具有重要的臨床意義，尤其是對(duì)高危地區(qū)和高危人群的鼻咽癌篩查和鼻咽癌患者的預(yù)后有重要的實(shí)用價(jià)值。

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Clinical significance of plasma Epstein-Bar virus DNA concentration in the diagnosis and treatment of nasopharyngeal carcinoma.

LIU Wen-ju,DU Kun.Department of Clinical Laboratory,the First Affiliated Hospital of Yangtze University,Jingzhou 434000,HuBei,CHINA

ObjectiveTo investigate the clinical significance of plasma Epstein-Bar virus DNA (EBV-DNA)concentration in the diagnosis and treatment of nasopharyngeal carcinoma(NPC).MethodsFluorescence quantitative PCR was used to determine the content of EBV-DNA in blood serum in 56 patients with NPC(the study group)and 50 healthy individuals(the control group).ResultsThe positive rate of EBV-DNA was 92%(46/ 50)in the study group and 8%(4/50)in the control group.Among the 46 patients detected positive in the study group, 26 patients were detected with significantly decreased EBV-DNA at the first week of treatment,and with no EBV-DNA at the end of the treatment.Fourteen patients were detected with high levels of EBV-DNA at the initial weeks of treatment,but with no EBV-DNA at the end of the treatment.Six patients were found to maintain a high levels of EBV-DNA throughout the treatment.ConclusionDetermination of EBV-DNA by fluorescence qualitative PCR in blood serum is reliable and sensitive,which has high clinical value in the diagnosis and treatment of NPC.

Fluorescence qualitative PCR;Nasopharyngeal carcinoma;EBV-DNA;Plasma

R739.63

A

1003—6350（2012）18—007—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2012.18.003

2012-03-19）

柳文菊（1971—），女，湖北省荊州市人，主管技師，學(xué)士。