黃潤蕓，陳 凱，崔清華，李慧芬，張曉平，田景振

(山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355)

板藍(lán)根(Radix Isatidis)是十字花科植物菘藍(lán)Isatis indigotica Fort.的干燥根，具有清熱解毒、涼血利咽的功效，臨床上主要用于溫?zé)岵岫救胗跔I血及溫?zé)岵〕跗鸹蛲飧酗L(fēng)熱諸癥［1］。有研究表明板藍(lán)根中總生物堿是其抗病毒有效物質(zhì)［2］，目前板藍(lán)根總生物堿的含量測定方法尚未見文獻(xiàn)報道，本實(shí)驗(yàn)采用酸性染料比色法建立板藍(lán)根總生物堿含量測定方法，并進(jìn)行方法學(xué)考察，可以滿足板藍(lán)根總生物堿含量測定的需要。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 UV－2010型紫外可見分光光度計(jì)(日立公司)。

1.2 試藥 4－(3H)－喹唑啉(Sigma公司，批號:20100521)，磷酸二氫鉀(分析純，天津科密歐，批號:20071126)，溴麝香草酚藍(lán)(分析純，天津科密歐，批號:20041024)，732離子交換樹脂(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑，批號:10024260)，蒸餾水，其他試劑均為化學(xué)純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取4(3H)－喹唑啉對照品10.0 mg，置100 mL容量瓶中，1%鹽酸乙醇溶液溶解并定容，搖勻，作為對照品溶液(每1 mL含4(3H)－喹唑啉1 mg)。

2.1.2 供試品溶液的制備 稱取板藍(lán)根最粗粉20 g，加入一定量的80%乙醇水溶液，浸泡36 h，裝入滲漉筒中(3×10 cm)。用15倍量80%乙醇水溶液滲漉提取，流速控制為1 mL·min－1。收集滲漉液，回收溶劑至近干，用80%乙醇溶液溶解并定容至50 mL容量瓶中，作為供試品溶液。

2.2 不同pH值緩沖溶液的制備

2.2.1 pH 4.5醋酸－醋酸鈉緩沖液的配制 稱取醋酸鈉18 g，加冰醋酸9.8 mL，溶解后再加水稀釋至1000 mL，即得。

2.2.2 pH 5.0 磷酸鹽緩沖液的配制 取 0.2 mol·L－1磷酸二氫鈉溶液一定量，用氫氧化鈉試液調(diào)節(jié)pH值至5.0，即得。

2.2.3 pH 6.0醋酸－醋酸鈉緩沖液的配制 稱取醋酸鈉54.6 g，加 1 moL·L－1醋酸溶液 20 mL，溶解后加水稀釋至500 mL，即得。

2.2.4 pH 6.8磷酸二氫鉀緩沖液的配制 取 0.2 moL·L－1磷酸二氫鉀溶液 250 mL，加 0.2 moL·L－1NaOH 118 mL，用水稀釋至1000 mL，即得。

2.2.5 pH 7.6磷酸二氫鉀緩沖液的配制 稱取磷酸二氫鉀27.22 g，加水使溶解成 1000 mL，取50 mL 加0.2 moL·L－1NaOH溶液42.4 mL，再加水稀釋至200 mL，即得。

2.2.6 溴麝香草酚蘭溶液的配制 精密稱取溴麝香草酚蘭0.0300 g，溶于1 moL·L－1NaOH 溶液0.5 mL 中，加水稀釋并定容至100 mL容量瓶中。

2.3 檢測波長的選擇 分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各1 mL置分液漏斗中，加入5 mL醋酸－醋酸鈉緩沖液和5 mL溴麝香草酚蘭溶液，搖勻，用40 mL三氯甲烷分4次萃取，每次10 mL。收集三氯甲烷萃取液定容至50 mL容量瓶中。以三氯甲烷作空白掃描紫外全波長圖譜(酸性染料緩沖液不做空白，因其在該波長處紫外吸收無干擾)。二者在417.5 nm處均有最大吸收，故選擇檢測波長為417.5 nm。

圖1 對照品溶液全波長掃描圖 圖2 供試品溶液全波長掃描圖

2.4 含量測定方法相關(guān)條件單因素考察研究

2.4.1 不同pH值緩沖液考察 精密吸取0.5 mL供試品溶液5份置分液漏斗，分別加入5 mL 2.2項(xiàng)下不同pH值為:4.76、5.20、6.10、6.75、7.62 的緩沖液，再加入5 mL 0.03 g·(100 mL)－1溴麝香草酚蘭溶液，搖勻，用40 mL三氯甲烷分4次萃取，每次10 mL。收集三氯甲烷萃取液定容至50 mL容量瓶中，以三氯甲烷作空白，于417.5 nm處測吸光度。測得吸光度分別為:0.348、0.450、0.640、0.216、0.018。由此選擇緩沖液pH值為:6.10。

2.4.2 酸性染料用量考察 精密吸取0.5 mL供試品溶液5份置分液漏斗中，分別加入5 mL pH 6.0醋酸－醋酸鈉緩沖液，再分別加入1、2、3、4、5、6 mL 0.03 g·(100 mL)－1溴麝香草酚蘭溶液，其余操作同2.4.1 項(xiàng)下。測的吸光度分別為:0.146、0.261、0.506、0.564、0.690、0.678。由此選擇酸性染料用量為5 mL。

2.4.3 緩沖液用量的考察 精密吸取0.5 mL供試品溶液5份至分液漏斗，分別加入 3、4、5、6、7 mL pH 6.0 醋酸 － 醋酸鈉緩沖液，再分別加入5 mL 0.03 g·(100 mL)－1溴麝香草酚蘭溶液，其余操作同 2.4.1項(xiàng)下。測得吸光度分別為:0.716、0.735、0.752、0.736、0.727。由此選擇緩沖液用量為5 mL。

2.4.4 三氯甲烷萃取液用量考察 精密吸取0.5 mL供試品溶液5份至分液漏斗，分別加入5 mL pH 6.0醋酸－醋酸鈉緩沖液，再分別加入5 mL 0.03 g·(100 mL)－1溴麝香草酚蘭溶液，搖勻，分別用三氯甲烷萃取1、2、3、4、5 次，每次10 mL。其余操作同 2.4.1 項(xiàng)下。測得吸光度分別為:0.465、0.592、0.678、0.691、0.696。由此選擇三氯甲烷萃取4 次，每次10 mL。

綜上所述，選擇pH 6.0醋酸－醋酸鈉緩沖液溶液，緩沖液用量為5 mL，溴麝香草酚蘭溶液用量為5 mL，三氯甲烷萃取4次，每次10 mL。

2.5 線性關(guān)系的考察 精密吸取 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL對照品溶液，加5 mL pH 6.0醋酸－醋酸鈉緩沖液，加入5 mL 0.03 g·(100 mL)－1溴麝香草酚蘭溶液，搖勻，用三氯甲烷萃取4次，每次10 mL。收集三氯甲烷萃取液定容至50 mL容量瓶中，以三氯甲烷作空白，于417.5 nm處測吸光度，由實(shí)驗(yàn)結(jié)果得線性回歸方程為:Y=0.023X+0.222，r=0.9999。說明4(3H)－ 喹唑啉在 4 ～24 μg· mL－1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6 精密度實(shí)驗(yàn) 從同一批次供試品溶液中精密吸取0.5 mL溶液6份，按2.4項(xiàng)下方法處理并測定吸光度，RSD=0.16%，表明儀器精密度良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取板藍(lán)根粉末6份，各1.0g，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，取供試品溶液0.5 mL，置于分液漏斗中，按“2.4”項(xiàng)下方法操作，于 417.5 nm處依法測定吸光度，計(jì)算其平均含量為23.20%，RSD為0.14%。表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.8 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 從供試品溶液中精密吸取0.5 mL溶液，按2.4項(xiàng)下方法處理并測定吸光度，從第一次測A開始計(jì)時，分別測定0、15、30、45、60、90、120 min 后的吸光度，樣品2 h內(nèi)顏色無明顯變化，吸光度RSD=1.04%，表明供試品溶液在120 min內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

2.9 加樣回收試驗(yàn) 從已知濃度的供試品中精取0.5 mL溶液6份，分別加入0.2 mL對照品溶液，按2.4項(xiàng)下方法處理并測定吸光度，計(jì)算加樣回收率(n=6)，平均回收率為100.3%，RSD=2.17%。

3 不同批次板藍(lán)根中總生物堿含量測定

從3批板藍(lán)根中各取20 g，按2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取0.5 mL，按2.4項(xiàng)下方法測定總生物堿含量，每批次測3次取平均值，3批藥材中總生物堿含量分別為:5.81%、5.79%、5.83%，RSD=0.34%。

4 小結(jié)與討論

在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)溴麝香酚藍(lán)顯色劑放置一段時間后會不穩(wěn)定，因此顯色劑應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配，從而保證測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。此外，嚴(yán)禁在三氯甲烷萃取液中混入水分，否則會使溶液變渾濁，影響比色結(jié)果。所以在測定吸光度前，必須用脫水劑(如無水硫酸鈉)除去萃取溶劑中的水分。有研究表明板藍(lán)根抗病毒物質(zhì)基礎(chǔ)是總生物堿，而2010版《中國藥典》中僅對(R，S)－告依春(C5H7NOS)含量做明確要求，故筆者認(rèn)為對總生物堿的含量測定考察有相當(dāng)?shù)囊饬x?？偵飰A的含量測定方法有酸堿中和滴定法和酸性染料比色法，兩種方法相比較而言，前者的含量測定結(jié)果誤差較大［3］，而后者準(zhǔn)確性較好，靈敏度更高，重現(xiàn)性好。本實(shí)驗(yàn)建立了酸性染料比色法測定板藍(lán)根總生物堿含量，適用于板藍(lán)根總生物堿的含量測定。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2010年版(一部)［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:191.

［2］ELLiott MC.Compands from isatis indigotica［J］.Phytochemistry，1970，9:1629.

［3］劉喜綱，劉翠哲，常金花.應(yīng)用酸性染料比色法測定總生物堿的含量［J］.中國藥房，2007，18(11):875 －876.