王筱梅，劉少奎，陳士毅，洪軍，穆鑫，王翠榮，趙越超

血管內膜損傷是血管腔狹窄的始動因素，而狹窄的關鍵在于血管平滑肌細胞增殖遷移致內膜增生，血管外膜炎癥、外膜成纖維細胞、外膜脂肪組織等均可能與內膜病變的發(fā)生相關[1]。文獻報道[2]，在小鼠的股動脈上安置聚乙烯套管可造成血管損傷，發(fā)生血管重塑，導致血管腔內徑變小，血管壁的結構和厚度發(fā)生改變。而這些改變正是心血管疾病如高血壓、冠心病、血管成形術后再狹窄發(fā)生發(fā)展的共同基礎。研究發(fā)現(xiàn)，血管緊張素轉換酶受體拮抗劑類藥物具有抑制血管重塑[3]等作用。本研究通過建立小鼠血管損傷模型，給予臨床上常用的血管緊張素轉換酶受體拮抗劑纈沙坦，觀察血管內膜、中膜面積的變化以評價血管緊張素轉換酶受體拮抗劑類藥物纈沙坦在抑制損傷血管內膜增厚和血管重構重構方面的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 8周齡雄性C57BL/6野生型小鼠80只，體重（30～35）g【購自大連醫(yī)科大學實驗動物中心，許可證號SCXK（遼）2010-0003】。隨機分為4組（每組20只）：手術組、治療組、假手術組、對照組。手術組：行聚乙烯套管包裹股動脈手術，術后開始蒸餾水灌胃治療（1 ml/次，qd）；治療組：行聚乙烯套管包裹股動脈手術，術后開始纈沙坦灌胃治療（10 mg/kg，qd）；假手術組：游離出股動脈不套管，術后不灌胃；對照組：不手術，不灌胃。統(tǒng)一于第14天處死小鼠。

1.2 聚乙烯套管包裹股動脈手術 手術在室溫下進行，1%戊比妥鈉（50 mg/kg）腹腔注射麻醉，沿腹股溝中點縱行切開皮膚，暴露股動脈鞘，游離出股動脈，長約3mm。用2.0mm的PE-50聚乙烯套管（內徑：0.56mm；外徑：0.965mm；美國 Becton Dickinson 公司），縱向切開后松散地包裹于股動脈外，以8號縫線捆綁固定，雙側股動脈復位。套管內徑大于股動脈管徑，不阻礙血液流動。逐層縫合傷口，使小鼠自行恢復。據(jù)文獻報道，套管處內膜增厚則提示造模成功[4，5]。術后予腹腔注射青霉素16萬單位預防感染（qd×3d）。

1.3 標本采集、保存及血管形態(tài)學觀察 腹腔注射過量戊比妥鈉處死，先用心臟插管注入PBS液沖洗血管，同時剪碎肝臟迅速放血，盡量使股動脈內的血液流出，應用PBS液沖洗并保持股動脈結構不破壞，剪取約2mm，各組隨機抽取15條不同小鼠股動脈，置于4%的多聚甲醛溶液中固定10小時，石蠟包埋待用。標本處理：取股動脈兩端和中部按5μm厚度連續(xù)切片（每部分取3張切片觀察），蘇木素和伊紅（HE）染色后，在光學顯微鏡下數(shù)碼照相后輸入計算機。血管內彈性板與血管腔之間的面積定義為新生內膜面積，新生內膜和中膜的面積采用NIH分析軟件測量，準確勾出外彈力膜（EEL）、內彈力膜（IEL）以及管腔輪廓，測算出內膜面積、中膜面積，其中內膜面積=[(內彈力膜周徑)2-(管腔周徑)2]/4π,中膜面積=[(外彈力膜周徑)2-(內彈力膜周徑)2]/4π。每個目標血管取3張切片測量后的平均值。

1.4. 統(tǒng)計學分析 采用SPSS17.0統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料以均值±標準差（）表示。形態(tài)學分析多組間比較，采用完全隨機設計單因素方差分析，多個樣本均數(shù)間兩兩比較采用SNK-q法；組內比較采用配對t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 模型評價及血管形態(tài)學比較 鏡下觀察小鼠股動脈病理切片，正常組與假手術組內膜為單層單核細胞，未見增厚；手術組、治療組套管處內膜則呈城墻樣折疊，血管內膜增厚；手術組內膜增厚明顯。中膜為染色為紅色的除內膜外的部分，假手術組、手術組、治療組的中膜與對照組比較無增厚（圖1）。

2.2 內膜和中膜面積比較（表1） 對照組、假手術組未見新生內膜形成，手術組與治療組有新生內膜形成。手術組與其余3組比較，新生內膜面積均值較大，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；治療組較對照組新生內膜增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），證明造模成功且藥物治療不能完全抑制血管內膜增生。各組中膜中膜面積比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表1 各組新生內膜面積、中膜面積比較( ,μm2)

3 討論

血管重構是心腦血管疾病發(fā)生發(fā)展的基本病理改變，抑制血管重構，保護血管內皮，控制動脈硬化的始動環(huán)節(jié)，是防治心血管疾病的新趨勢與重要研究方向。

長期以來人們研究所采用的多為apoE(-／-)小鼠高脂飲食、動脈結扎阻礙血流法的動物模型，但是鑒于臨床心血管疾病趨于年輕化及目前研究認為血管外膜與內膜存在相關性，若能以非動脈硬化危險因素參與、非動脈內皮細胞增殖為動脈硬化形成始動因素的模型作為研究對象更具有現(xiàn)實意義。依據(jù)國外文獻報道，采用聚乙烯套管方法致小鼠動脈損傷模型很好地滿足了上述條件。由于血管周圍異物的刺激，次日在造膜部位便可產生強烈的炎性反應，2周后血管腔內膜明顯增生；病理顯示增生的內膜主要以平滑肌細胞為主，這種病理改變與人類動脈硬化的內膜病變具有相似性[4、5]。故本實驗選用該模型反應血管重構情況。我們在日本學者Hirosumi等成功的在兔子頸動脈上開發(fā)了塑料微導管血管損傷模型基礎上，根據(jù)學者Akishita、Moroi等在小鼠股動脈建立損傷模型的方法，成功建立小鼠股動脈塑料微導管損傷模型（Cuff植入模型）。

上世紀60年代Wilcox就提出，在動脈粥樣硬化損傷血管外膜周圍存在有炎癥和纖維化[6]。在小鼠股動脈周圍無菌性炎癥的實驗觀察中發(fā)現(xiàn)，細胞粘附分子-1（ICAM-1）,血管細胞粘附分子-1（VCAM-1）在外膜早期都有所表達，隨著炎癥反應的逐漸增加，小鼠股動脈內膜也逐漸出現(xiàn)了ICAM-1和VCAM-1，提示血管外膜炎癥可能會導致血管內皮細胞功能障礙[7]。血管內皮增生是血管平滑肌細胞在損傷過程中向內膜增殖和遷移的特征性表現(xiàn)[8,9]，Viswanathan等[10]發(fā)現(xiàn)大鼠頸動脈內皮損傷后，增殖的血管平滑肌細胞中血管緊張素AT1受體表達增多，提示損傷的局部血管壁血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）增多。我們推測，血管緊張素轉換酶抑制劑（ACEI）或血管緊張素轉換酶受體拮抗劑（ARB）可通過阻斷AngⅡ的介導反應，從而抑制血管內皮細胞的表達，影響血管重構，延緩動脈硬化及心血管病的進展。

研究結果顯示，對照組、假手術組病理切片均未見中膜增厚，也未見明顯的新生內膜形成，表明手術操作未對血管外膜造成刺激，可除外人為的手術操作對血管內膜造成的影響；手術組與對照組比較未見中膜增厚，但可見內膜細胞明顯增生，進一步證實血管外膜炎癥可通過促使平滑肌細胞遷移致使血管內皮細胞增殖，導致內膜增厚、管腔狹窄，進一步加速動脈硬化及心血管疾病的發(fā)展。治療組血管內膜增厚面積較手術組明顯減輕，說明纈沙坦能夠抑制血管平滑肌細胞向內膜增殖和遷移，進而抑制血管外膜炎癥所致的內膜增生作用。

本實驗采用國外多見而國內少有的小鼠股動脈塑料微導管損傷模型（Cuff植入模型），結合病理切片檢測，表明血管外膜受到無菌性炎癥刺激后會導致血管內膜異常增生[11]，因此研究組認為在動脈硬化，血管再狹窄等疾病的發(fā)生發(fā)展中，血管外膜也起到了很重要的作用。纈沙坦能夠明顯抑制血管損傷后內膜增生，防止血管重構的作用，其機制可能與抑制AngⅡ有關，對動脈硬化、血管損傷后再狹窄等心血管疾病有一定的治療意義。

本實驗不足之處在于觀察時間較短，而纈沙坦對內膜增生抑制效應是否能夠長期有效還需進一步證實。

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