朱琳琳 陳紹良 張娟 劉志忠

（南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京第一醫(yī)院心內(nèi)科，江蘇 南京 210006）

內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells，EPCs）是血管內(nèi)皮的前體細(xì)胞，存在于成年機(jī)體的骨髓及外周血中，在成體血管新生中起重要作用。雷帕霉素是一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，具有抗真菌、免疫抑制以及抗腫瘤作用。紫杉醇是一種抗增殖藥物，具有抗腫瘤作用。在冠狀動(dòng)脈介入治療術(shù)中應(yīng)用雷帕霉素或紫杉醇藥物洗脫支架，可顯著降低支架內(nèi)再狹窄的發(fā)生率。本研究旨在探討雷帕霉素和紫杉醇對(duì)體外培養(yǎng)的大鼠骨髓來(lái)源的EPCs的數(shù)量及其增殖能力、遷移能力和黏附能力的影響。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要試劑 體質(zhì)量為100 g左右的雄性SD（Sprague Dawley）大鼠10只，由南京醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。異硫氰酸熒光素標(biāo)記的單葉豆凝集素1（FITC－BS－1 lectin）、雷帕霉素和紫杉醇購(gòu)自SIGMA公司；DiI標(biāo)記的乙酰化低密度脂蛋白（DiI－acLDL）購(gòu)自 Molecular Probes公司。細(xì)胞培養(yǎng)液為DMEM（購(gòu)自GIBCO公司），含10%胎牛血清（購(gòu)自Hyclone公司）。

1.2 EPCs的分離和培養(yǎng) 將SD大鼠斷頸處死，置于70%乙醇中20～30 min，無(wú)菌條件下分離大鼠的股骨和脛骨，去除附著于骨的軟組織和骨骺端。將分離的股骨和脛骨移入無(wú)菌平皿，用5 mL磷酸緩沖液（PBS）將骨髓沖出，用200目濾網(wǎng)過(guò)濾骨髓并以2000 r／min離心5 min。將沉淀細(xì)胞重懸于10 mL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，以2×106／孔接種于明膠包被的24孔培養(yǎng)板上，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。接種后4 d用PBS沖洗去掉未貼壁細(xì)胞，更換培養(yǎng)液培養(yǎng)至7 d，再次用PBS沖洗去掉未貼壁細(xì)胞，得到貼壁細(xì)胞供后續(xù)實(shí)驗(yàn)用。

1.3 細(xì)胞染色及鑒定 將貼壁細(xì)胞隨機(jī)分為7組：A 組：雷 帕 霉 素 5.0μg／mL；B 組：雷 帕 霉 素1.0μg／mL；C組：雷帕霉素0.1μg／mL；D組：紫杉醇5.0μg／mL；E組：紫杉醇1.0μg／mL；F組：紫杉醇0.1μg／mL；G組：對(duì)照組，加入溶劑二甲基亞砜（DMSO）。各組細(xì)胞在含相應(yīng)濃度藥物的10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h。對(duì)貼壁細(xì)胞進(jìn)行 DiI－acLDL和 FITC－BS－1 Lectin雙標(biāo)記，將染色雙陽(yáng)性者認(rèn)定為EPCs。具體方法：細(xì)胞與DiI－acLDL（2.4μg／mL）在37℃下孵育1 h，觀察EPCs對(duì)DiI－acLDL的攝取。然后以2%多聚甲醛固定細(xì)胞10 min，固定后用PBS浸洗，將FITC－BS－1 Lectin（10μg／mL）加于上述標(biāo)本中，在37℃下孵育1 h后用激光共聚焦顯微鏡鑒定，雙染色陽(yáng)性細(xì)胞為正在分化的EPCs。采用倒置熒光顯微鏡進(jìn)行計(jì)數(shù)（計(jì)數(shù)10個(gè)隨機(jī)選擇的×200視野的EPCs）。

1.4 EPCs黏附能力的檢測(cè) 用0.25%胰蛋白酶消化貼壁細(xì)胞，將其懸浮于500μL培養(yǎng)液中，計(jì)數(shù)。每組以相同數(shù)目EPCs接種在明膠包被的培養(yǎng)板上，37℃下培養(yǎng)30 min后，計(jì)數(shù)貼壁細(xì)胞。

1.5 EPCs遷移能力的檢測(cè) 采用改良的Boyden小室法分析。用0.25%胰蛋白酶消化，搜集貼壁細(xì)胞，將其懸浮于500μL培養(yǎng)液中，計(jì)數(shù)。每組將相同數(shù)目的EPCs懸浮于50μL培養(yǎng)液注入上室，下室分別加入DMSO、不同濃度的雷帕霉素和紫杉醇以及25μL培養(yǎng)液，37℃下培養(yǎng)24 h，小心刮去濾膜上層的未移動(dòng)細(xì)胞，用甲醇固定，Giemsa染色，隨機(jī)選擇3個(gè)顯微鏡視野（×200），計(jì)數(shù)遷移至下層的細(xì)胞。

1.6 EPCs增殖能力的檢測(cè) 將等量的EPCs接種于明膠包被的96孔培養(yǎng)板上，每孔加入10μL MTT（5 g／L），培養(yǎng)4 h后，去除上清液，再加入DMSO（150μL／孔），用微振蕩器振蕩10 min，用酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)490 nm處測(cè)OD值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS16.0軟件包進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析與兩兩比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 EPC的鑒定 將大鼠骨髓中分離獲得的細(xì)胞培養(yǎng)7 d后，形成了梭形的內(nèi)皮樣細(xì)胞。用DiI－ac LDL和FITC－BS－1 Lectin對(duì)細(xì)胞染色后，通過(guò)激光共聚焦顯微鏡鑒定，DiI－ac LDL和FITC－BS－1 Lectin雙染色陽(yáng)性細(xì)胞被認(rèn)為是正在分化的EPCs，并在倒置熒光顯微鏡200倍下計(jì)數(shù)10個(gè)隨機(jī)選擇的視野中的EPCs。

2.2 不同濃度雷帕霉素和紫杉醇對(duì)EPCs數(shù)量的影響 雷帕霉素及紫杉醇各組與對(duì)照組相比，EPCs數(shù)量均較少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。隨著雷帕霉素、紫杉醇濃度的增加，EPCs的數(shù)量逐漸減少（P＜0.05）。相同濃度的雷帕霉素和紫杉醇對(duì)EPCs的數(shù)量的影響無(wú)顯著差異（圖1和表1）。

圖1 各組在激光共聚焦顯微鏡下的正在分化的EPCs（×200）

2.3 不同濃度雷帕霉素和紫杉醇對(duì)EPCs黏附能力的影響 雷帕霉素和紫杉醇各組與對(duì)照組相比，EPCs的黏附能力低。隨著雷帕霉素、紫杉醇濃度的增加，EPCs的黏附能力逐漸降低。相同濃度的雷帕霉素和紫杉醇對(duì)EPCs黏附能力無(wú)顯著影響，見(jiàn)表1。

2.4 不同濃度雷帕霉素和紫杉醇對(duì)EPCs遷移能力的影響 雷帕霉素及紫杉醇各組與對(duì)照組相比，EPCs遷移能力降低。隨著雷帕霉素、紫杉醇濃度的增加，EPCs的遷移能力逐漸降低。相同濃度的雷帕霉素和紫杉醇對(duì)EPCs遷移能力無(wú)顯著影響，見(jiàn)表1。

2.5 不同濃度雷帕霉素和紫杉醇對(duì)EPCs增殖能力的影響 雷帕霉素及紫杉醇各濃度組與對(duì)照組相比，EPCs增殖能力降低。隨著雷帕霉素、紫杉醇濃度的增加，EPCs的增殖能力逐漸降低。相同濃度的雷帕霉素和紫杉醇對(duì)EPCs增殖無(wú)顯著影響，見(jiàn)表1。

表1 不同濃度雷帕霉素和紫杉醇對(duì)EPCs數(shù)量與功能的影響

3 討 論

血管內(nèi)皮損傷是冠狀動(dòng)脈斑塊形成中的關(guān)鍵起始步驟，因此內(nèi)皮損傷后的完全修復(fù)非常重要。內(nèi)皮修復(fù)可以借助損傷周圍成熟內(nèi)皮細(xì)胞的遷移及增殖完成，但成熟內(nèi)皮細(xì)胞是已分化細(xì)胞，其增殖能力有限。EPCs具有分化為成熟內(nèi)皮細(xì)胞的能力，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床研究表明［1－2］，新生血管中25%的內(nèi)皮細(xì)胞是由EPCs分化而來(lái)。EPCs在外傷愈合［3］、心肌梗死后修復(fù)［4］及移植血管內(nèi)皮化［5］等過(guò)程中起促進(jìn)作用。在球囊損傷血管模型中，EPCs能結(jié)合到血管損傷部位，促進(jìn)血管再內(nèi)皮化［6］。

在心血管病介入治療中，藥物洗脫支架（drug eluting stent，DES）已得到廣泛應(yīng)用，目前美國(guó)食品和藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)的DES為紫杉醇洗脫支架和雷帕霉素洗脫支架。雷帕霉素是一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，具有抗血管形成、抗腫瘤生長(zhǎng)的作用。其與細(xì)胞內(nèi)雷帕霉素連接蛋白結(jié)合形成的復(fù)合物能抑制調(diào)節(jié)性激酶－雷帕霉素耙（target of rapamycin，TOR），抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)錄過(guò)程，從而使細(xì)胞分裂受阻于G1期而不能進(jìn)入S期。在增殖分化的EPCs中也存在調(diào)節(jié)性激酶TOR，因此雷帕霉素能抑制EPCs的增殖和分化。雷帕霉素可降低體外培養(yǎng)的人外周血來(lái)源的EPCs的數(shù)量，抑制其增殖、遷移、黏附和血管形成，并抑制內(nèi)皮一氧化氮合成酶（eNOS）產(chǎn)生［7］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，雷帕霉素可以降低體外培養(yǎng)的大鼠骨髓來(lái)源的EPCs的數(shù)量，并抑制其增殖、遷移、黏附的能力，且呈濃度依賴性。

紫杉醇是一種抗增殖藥物，它可與微管蛋白結(jié)合，穩(wěn)定微管結(jié)構(gòu)，阻斷細(xì)胞有絲分裂，從而抑制細(xì)胞的增殖。低劑量的紫杉醇可通過(guò)誘導(dǎo)p53／p21腫瘤抑制基因，影響細(xì)胞分裂的G0－G1及G1－S期；而高劑量紫杉醇則影響細(xì)胞分裂的G2－M期和M－G1期，可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞壞死或凋亡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，紫杉醇降低了體外培養(yǎng)的大鼠骨髓來(lái)源的EPCs的數(shù)量，并且可以抑制其增殖、遷移、黏附的能力，且呈濃度依賴性。

DES的應(yīng)用顯著降低了支架內(nèi)再狹窄的發(fā)生率，但也導(dǎo)致了血管內(nèi)皮化延遲以及支架內(nèi)血栓發(fā)生率的增加。雷帕霉素和紫杉醇對(duì)EPCs的抑制作用可能是導(dǎo)致內(nèi)皮化延遲的原因之一，因而用藥物或細(xì)胞移植增加EPCs的數(shù)量并改善其功能可能會(huì)促進(jìn)DES術(shù)后患者內(nèi)皮的修復(fù)，降低支架內(nèi)血栓發(fā)生率。體外實(shí)驗(yàn)［8］顯示，恒磁場(chǎng)可促進(jìn)EPCs的增殖和遷移，糖原合酶激酶－3β抑制劑加雷帕霉素包被支架可促進(jìn)EPCs黏附，改善雷帕霉素導(dǎo)致的內(nèi)皮化延遲。但目前促進(jìn)內(nèi)皮修復(fù)的辦法尚不能達(dá)到理想的遠(yuǎn)期效果，需要繼續(xù)探討內(nèi)皮修復(fù)的新措施。

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