毛文超 宋藝君 張 健 焦藝博 馮麗莉 白薈芳 王秀萍 蔡大勇 王玥琦

1.北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 (北京，100029) 2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所

筆者觀察熊果酸和熊果酸聯(lián)合枸杞子對(duì)二乙基亞硝胺誘導(dǎo)的小鼠肝癌前病變的防護(hù)作用，對(duì)比此兩種用藥方法的療效，為臨床聯(lián)合用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試劑與儀器 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：昆明種小鼠，雄性，體重20～22g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證號(hào) SCXK-京-2006-0009。藥品試劑：①二乙基亞硝胺(DEN)：0.95g/ml，批號(hào)：078K1635，美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品。99 ml生理鹽水加1ml DEN振蕩混勻?yàn)?% 的DEN溶液 (4℃保存)。②熊果酸：南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司生產(chǎn) (純度90.012%)，加蒸餾水配制成濃度為15mg/ml的熊果酸藥液。③枸杞子水煎液：枸杞子購(gòu)于北京圣惠堂中藥飲片有限公司(批號(hào)：090422)，稱取枸杞子67.8g，加10倍水煮沸后，文火煎煮30分鐘，煎煮兩次，3層紗布過(guò)濾，收集濾液濃縮至370ml，即濃度為0.18g/ml的枸杞子水煎液，4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩＂芨喂δ茉噭┖校喊ū彼徂D(zhuǎn)氨酶 (ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶 (AST)、堿性磷酸酶 (ALP)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶 (GST)檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自南京建成生物工程研究所 (批號(hào)：20100205)。主要儀器：Multiskan MK3酶標(biāo)儀 (上海熱電儀器有限公司產(chǎn)品)，AL104-IC型精密電子天平 (上海梅特勒托利多儀器有限公司)，LG16-W型臺(tái)式高速離心機(jī) (北京京立離心機(jī)有限公司)，電子恒溫水浴箱 (北京長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表公司)，定量移液器 (上海大龍醫(yī)療設(shè)備有限公司)，德國(guó)LETIZ公司FS/FAS 5030石蠟切片機(jī)，日本濱松Nano Zoomer Digital Pathology數(shù)字病理掃描系統(tǒng)等病理科常規(guī)設(shè)備。Image-Pro Plus 7.0 morphometric analysis system(版本 7.0.1，序列號(hào)41N70000-60555，Media Cybernetics，USA)，JJ1000型電子分析天平 (美國(guó)雙杰兄弟集團(tuán)有限公司常熟雙杰測(cè)試儀器廠)。

1.2 動(dòng)物分組處理 40只小鼠體重均衡隨機(jī)分為4組，即正常組、模型組、熊果酸組、聯(lián)合用藥組。腹腔注射及灌胃劑量均按小鼠體重計(jì)。正常組小鼠每周1次 (周六12am)行腹腔注射生理鹽水 0.1ml/10g，連續(xù) 10次;同時(shí) 1次/d，(8am)灌胃生理鹽水0.1ml/10g，連續(xù)10周。模型組小鼠每周1次 (周六12am)行腹腔注射1%DEN溶液0.1ml/10g，連續(xù)10次，復(fù)制小鼠肝癌前病變模型。熊果酸組小鼠，造模型方法同模型組，同時(shí)1次/d(8am)灌胃熊果酸 (4.5mg/20g)藥液0.1ml/10g，共10周。聯(lián)合用藥組小鼠造模同模型組，同時(shí)1次/d，(8am)灌胃熊果酸藥0.1ml/10g，每天4pm灌胃枸杞子 (12mg/10g)水煎液0.1ml/10g，連續(xù)10周。

1.3 觀察指標(biāo)檢測(cè) ①一般狀況：實(shí)驗(yàn)過(guò)程中每日觀察記錄小鼠進(jìn)食狀況、體重、活動(dòng)情況及外表征象。②肝功能變化：第10周時(shí)，小鼠禁食12小時(shí)后稱量體重 (Wb)，眼球后靜脈取血0.5ml，全血離心 (1 500rpm×10min)，血清-80℃保存。按試劑盒說(shuō)明書測(cè)定ALT、AST、GST、ALP活性。③肝臟系數(shù)：小鼠取血后脫臼處死，沿腹正中線切口進(jìn)腹腔，切取全部肝臟，生理鹽水清洗血跡，濾紙吸干生理鹽水，稱重肝臟質(zhì)量 (Wl)，結(jié)合體重計(jì)算肝臟系數(shù) (Wb÷Wl×100%)。④病理變化：切取肝臟右葉，10ml 10%甲醛溶液固定48小時(shí)，常規(guī)石蠟包埋，4μm切片;同步烤片與脫蠟，梯度酒精水化，HE染色。20倍物鏡和光鏡觀察質(zhì)控蘇木素分化時(shí)間 (4秒最清晰)。梯度酒精脫水，二甲苯透明，樹(shù)脂封片;光鏡下胞漿紅染，核藍(lán)染。按標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范，使用Olympus顯微鏡20倍物鏡下隨機(jī)攝拍肝細(xì)胞團(tuán)顯微照片5張，由病理醫(yī)師閱片、診斷和評(píng)價(jià)，確定肝損傷病變性質(zhì)和病變程度。⑤形態(tài)計(jì)量：由于肝細(xì)胞水腫與增生肝細(xì)胞核異型性兩類病變分布均一，并且程度類似，符合形態(tài)計(jì)量的基本技術(shù)要求。20倍HE染色顯微照片，Image-Pro Plus顯微分析系統(tǒng)，形態(tài)計(jì)量肝索面積構(gòu)成比和增生肝細(xì)胞核面積構(gòu)成比。每只動(dòng)物5張20倍顯微照片的平均數(shù)為1個(gè)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。再以正常組與模型組平均數(shù)值，轉(zhuǎn)化原始數(shù)據(jù)為效能單位X=(Xi-Mcontrol) /(Mmodel-Mcontrol)，作矩形圖顯示用藥防護(hù)程度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有顯著性意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠的一般狀態(tài) 正常組小鼠活潑好動(dòng)，反應(yīng)靈活，皮毛光澤，體重逐漸增加，無(wú)死亡;模型組小鼠精神萎靡，行動(dòng)遲緩，食欲不振，皮毛枯槁、無(wú)光澤，體重先增加后降低，死亡1只;熊果酸組和聯(lián)合用藥組小鼠癥狀改善，活動(dòng)度和食量比模型組小鼠增加，精神尚可。

2.2 各組小鼠體重與肝系數(shù) 見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠體重與肝系數(shù)比較(±s)

表1 各組小鼠體重與肝系數(shù)比較(±s)

與正常組比較，a P ＜0.05，aa P ＜0.01; 與模型組比較，b P ＜0.05，bb P ＜0.01;與熊果酸組比較，c P ＜0.05，cc P ＜0.01

組別 用藥劑量(mg/kg)體重(g)肝臟重量(g)肝臟系數(shù)(%)正常組- 39.865 ±3.725 1.429 ±0.175 52.6223 ±1.9856模型組 - 29.50 ±4.84aa 1.124 ±0.246a 50.4783±3.2354a熊果酸組 225 30.29±1.601b 1.205±0.124b 51.5632 ±3.0297b聯(lián)合用藥組 112.5+1200 32.06 ±1.544bbc 1.352 ±0.069c 53.1209 ±1.4863c

2.3 各組小鼠血清肝功能情況 見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠血清肝功能比較(±s，U/L)

表2 各組小鼠血清肝功能比較(±s，U/L)

與正常組比較，a P＜0.05，aa P ＜0.01; 與模型組比較，b P ＜0.05，bb P ＜0.01;與熊果酸組比較，c P ＜0.05，cc P ＜0.01

組別ALT AST GST ALP正常組21.87 ±4.964 14.783 ±2.061 13.504 ±2.481 5.093 ±1.640模型組225.07 ±85.811aa 52.205 ±14.083aa 42.308 ±13.685a 25.141 ±3.638aa熊果酸組68.04 ±14.400bb 25.118 ±2.776bb 21.721 ±4.726bb 19.937 ±5.259b聯(lián)合用藥組63.73 ±27.407bbc 24.835 ±5.411bbc 18.590 ±3.81bc 22.525 ±5.101

2.4 各組小鼠肝臟病理情況 正常組小鼠肝臟結(jié)構(gòu)正常，有肝小葉和匯管區(qū) (見(jiàn)插頁(yè)圖1A)。肝小葉為規(guī)則肝細(xì)胞團(tuán);肝細(xì)胞索以中央靜脈為中軸，單行呈放射狀排列;相鄰肝板吻合連接成網(wǎng)狀，延伸到肝小葉周邊的界板。肝細(xì)胞為多面體形，肝細(xì)胞核圓，位于細(xì)胞中央，染色質(zhì)稀疏，著色較淺，核膜清楚，有1～2個(gè)核仁。肝細(xì)胞索之間為肝血竇，有內(nèi)皮與枯否氏細(xì)胞;匯管區(qū)：小葉之間的區(qū)域，有肝動(dòng)脈、門靜脈、膽管和少量結(jié)締組織，無(wú)顯著變性與壞死，無(wú)水腫、出血與浸潤(rùn)。

模型組小鼠肝臟以肝細(xì)胞發(fā)生變質(zhì)與增生為主要病變(見(jiàn)插頁(yè)圖1B)，包括細(xì)胞水腫與溶解壞死。肝細(xì)胞體積增大，胞漿淡染，胞漿內(nèi)水含量增加。肝細(xì)胞壞死發(fā)生在肝小葉內(nèi)、累積1個(gè)或幾個(gè)肝細(xì)胞的點(diǎn)狀壞死，未累及肝小葉界板的破壞;壞死灶原有肝細(xì)胞消失，代以浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞或漿細(xì)胞;累及肝小葉界板的點(diǎn)狀壞死為碎片狀壞死。累積十幾個(gè)或幾十個(gè)肝細(xì)胞的帶狀壞死，不累及肝小葉界板的破壞;壞死灶原有肝細(xì)胞消失，網(wǎng)狀纖維塌陷代以膠原纖維。累及肝小葉界板的帶狀壞死為橋接壞死。肝細(xì)胞增生：細(xì)胞漿嗜堿性染色，可有雙核。增生肝細(xì)胞具有癌細(xì)胞樣異型性，表現(xiàn)為細(xì)胞體積大，且大小不一致;細(xì)胞核的體積大、染色深與形態(tài)怪異，核仁數(shù)量多、體積大，甚至出現(xiàn)核內(nèi)包涵體;顆粒狀藍(lán)染胞漿，分布不均勻。匯管區(qū)可找到膽管增生和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。

熊果酸組小鼠肝臟病變性質(zhì)與模型組類似，程度減輕(見(jiàn)插頁(yè)圖1C)。增生細(xì)胞異型性較模型組減輕。溶解壞死很少累及肝小葉界板。匯管區(qū)有少量膽管增生和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。

聯(lián)合用藥組小鼠肝臟病變性質(zhì)與模型組類似，程度減輕顯著 (見(jiàn)插頁(yè)圖1D)。病變緩解，中央靜脈明顯，肝索放射狀排列，肝細(xì)胞異型性小，雙核細(xì)胞少見(jiàn)。匯管區(qū)有極少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。

2.5 4 組小鼠肝臟的病變程度 見(jiàn)圖2。形態(tài)計(jì)量數(shù)據(jù)分析見(jiàn)表3。結(jié)果顯示：與正常組比較，造模各組肝索構(gòu)成比、核構(gòu)成比顯著增加 (P＜0.01)，匯管區(qū)構(gòu)成比增加 (P＜0.05);與模型組比較，熊果酸組防治有效 (P＜0.05);聯(lián)合用藥組療效優(yōu)于熊果酸組 (P＜0.01)。效能單位轉(zhuǎn)化 (圖2)顯示，熊果酸對(duì)肝癌前病變有預(yù)防作用 (P＜0.05)，熊果酸與枸杞子聯(lián)合用藥的預(yù)防作用強(qiáng)于單用熊果酸 (P＜0.01)。

圖24 組小鼠肝臟病變程度的效能趨勢(shì)(xˉ±s，ni=8)

表34 組小鼠的肝臟病變比較(±s，ni=8)

表34 組小鼠的肝臟病變比較(±s，ni=8)

與正常組比較，a P＜0.05，aa P ＜0.01; 與模型組比較，b P ＜0.05，bb P ＜0.01;與熊果酸組比較，c P ＜0.05，cc P ＜0.01

組別 匯管區(qū)構(gòu)成比(v/v)肝索構(gòu)成比(v/v)核構(gòu)成比(v/v)正常組0.0086 ±0.0015 0.5141 ±0.0504 0.0143 ±0.0038模型組0.0435 ±0.0025a 0.7269 ±0.0166aa 0.0650 ±0.0035aa熊果酸組0.0301 ±0.0036b 0.6351 ±0.0235b 0.0481 ±0.0113bb聯(lián)合用藥組0.0182 ±0.0025bbcc 0.5847 ±0.0150bbc 0.0274 ±0.0074bbcc

3 討論

肝癌危害大［1］，在我國(guó)尤為明顯［2］，仍無(wú)有效防治辦法［3］。探索傳統(tǒng)中藥預(yù)防肝癌發(fā)病，有可能確定有效物質(zhì)［4］。按中醫(yī)藥理論，夏枯草、女貞子、山楂等含熊果酸的中藥大多歸肝經(jīng)，具有清肝火、散郁結(jié)、清熱解毒等功效，為證候特征依賴性肝癌預(yù)防類中藥，具有護(hù)肝、降脂、調(diào)節(jié)免疫、抗氧化、抗腫瘤等多種生物學(xué)活性［5，6］。大量研究表明熊果酸能通過(guò)多種機(jī)制誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡：①熊果酸對(duì)腫瘤的化學(xué)預(yù)防作用;②熊果酸的細(xì)胞毒活性;③熊果酸誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡作用;④腫瘤逆轉(zhuǎn)作用及抗侵襲性;⑤抑制腫瘤血管形成［7，8］。小鼠具有可基因干預(yù)發(fā)現(xiàn)靶點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)，二乙基亞硝胺誘發(fā)小鼠肝癌前病變模型被用于研究預(yù)防肝癌藥物篩選［9］。肝癌前病變往往與肝腎證候同患，熊果酸與枸杞子配伍成臨床方劑，預(yù)防肝癌前病變［4］。本研究以二乙基亞硝胺誘發(fā)肝癌前病變［10］的小鼠為研究對(duì)象，以臨床等效劑量的熊果酸或配伍枸杞子水提物［11］灌胃進(jìn)行預(yù)防，觀察小鼠體重、肝臟系數(shù)、肝功能損害、病理變化及其形態(tài)計(jì)量［12］，確定熊果酸對(duì)肝癌前病變的防治效應(yīng)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明熊果酸對(duì)肝癌前病變具有預(yù)防作用，與枸杞子聯(lián)用預(yù)防效果增強(qiáng)。突出表現(xiàn)在小鼠體重回升、肝系數(shù)恢復(fù)、肝功能異常緩解、增生肝細(xì)胞異型性減小，形態(tài)計(jì)量上降低核異型性顯著。

二乙基亞硝胺損害生物分子，引起致癌與抑癌功能失衡，肝細(xì)胞獲得遺傳性增殖能力，導(dǎo)致肝癌發(fā)生是一個(gè)漸變過(guò)程［13］。在預(yù)防癌癥同類候選藥中，熊果酸抗癌優(yōu)勢(shì)在于作用廣譜，主要表現(xiàn)為抗致癌，抗促癌［14］。枸杞子可以增強(qiáng)H22荷瘤小鼠脾臟中以樹(shù)突狀細(xì)胞 (DC)為主的抗原遞呈細(xì)胞的功能，提示其抗腫瘤免疫作用機(jī)制可能與此有關(guān)［15］。但與熊果酸聯(lián)合用藥協(xié)同預(yù)防肝癌前病變的機(jī)制還有待研究。

本研究確定熊果酸抑制誘導(dǎo)性肝癌前病變進(jìn)展，且與枸杞子聯(lián)用效應(yīng)增強(qiáng)。既探索了天然藥物預(yù)防肝癌的研究思路，也提供中醫(yī)臨床處方用藥的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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