徐 虹 李 汛 王魯文 龔作炯

武漢大學人民醫(yī)院感染科 (湖北武漢，430060)

急性肝功能衰竭是一種病因復雜、進展快、病情重、病死率高的臨床綜合征，其發(fā)病機制復雜，尚未闡明。但目前大多數(shù)學者支持由病毒直接或間接 (免疫反應)所致的原發(fā)性損害;由內(nèi)毒素及多種細胞因子如TNF-α、IL-4等介導的繼發(fā)性損傷的“兩次打擊”學說［1］。降鈣素原 (Procalcitonin，PCT)是無激素活性的前肽物質，是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種具有高特異性和敏感性的炎癥感染指標。本實驗通過建立D-氨基半乳糖鹽酸鹽誘導的大鼠急性肝衰竭 (acute liver failure，ALF)模型，觀察大鼠ALF時血清及組織中PCT水平的變化，探討PCT與細胞因子變化之間的關系。

1 材料與方法

1.1 動物模型的制備 將25只雄性Wistar大鼠 (武漢大學醫(yī)學部動物實驗中心，重200～220g)隨機分為兩組：①模型組20只，大鼠在禁食后12小時腹腔注射D-氨基半乳糖鹽酸鹽溶液 (江蘇省啟東市經(jīng)貿(mào)有限公司)，每只大鼠注射的劑量為1.2g/kg;②正常組5只，于大鼠腹腔內(nèi)注射等量生理鹽水，24小時后處死。模型組大鼠在造模后12小時及24小時，分別取10只大鼠用10%水合氯醛麻醉，行心臟采血，分離血清，-80℃凍存?zhèn)錂z。同時留取肝組織、脾組織、小腸組織各100mg，加入0.9%生理鹽水350μl，冰上勻漿，4℃離心后取上清液，-80℃凍存?zhèn)錂z。另取部分肝組織用10%甲醛溶液固定，行常規(guī)的石蠟包埋，切片，HE染色，觀察肝組織的病理學改變。

1.2 檢測指標與方法 ①血清及組織PCT的檢測：采用ELISA法檢測大鼠血清及肝臟、脾臟、小腸組織的PCT，實驗步驟按試劑盒 (上海西唐生物科技有限公司)說明書操作。②血清細胞因子水平的檢測：采用ELISA法檢測大鼠血清TNF-α、IFN-γ及IL-4，實驗步驟按試劑盒 (美國eBioscience公司)說明書操作。③內(nèi)毒素的檢測：鱟試劑檢測，實驗步驟按試劑盒說明書操作。

1.3 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。計量資料用(±s)表示，采用兩個獨立樣本非參數(shù)檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義，相關性分析采用pearson檢驗。

2 結果

2.1 兩組大鼠肝組織病理形態(tài)學變化 高倍鏡下顯示：正常組大鼠肝組織的肝小葉結構完整、清晰，肝細胞無變性壞死，炎癥活動度分級及纖維化程度分期分別為G0、S0，HAI積分0。模型組大鼠12小時肝細胞片狀壞死，肝索紊亂，炎癥細胞浸潤，肝組織炎癥活動度為G3;24小時時肝細胞大塊壞死，肝小葉結構失常，大量炎癥細胞浸潤，肝組織炎癥活動度為G4。見插見圖1。

2.2 兩組大鼠血清PCT、TNF-α、IFN-γ、IL-4及內(nèi)毒素水平變化 見表1。

正常組大鼠血清PCT的水平很低，PCT及TNF-α、IFN-γ、IL-4、內(nèi)毒素在模型組12小時時已有升高，24小時時仍持續(xù)在較高水平，各組間比較差異有顯著性意義 (P＜0.05)。

2.3 兩組大鼠組織PCT水平變化 見表2。由表2可知，正常組大鼠的肝臟、脾臟、小腸組織中也可檢測到PCT，但是在模型組12小時時迅速升高，24小時還持續(xù)在較高水平，各組間差異有顯著性意義 (P＜0.05)。

2.4 相關性分析 模型組大鼠血清PCT(12小時或24小時)與TNF-α、IFN-γ、IL-4、內(nèi)毒素 (12小時或24小時)成顯著正相關 (P ＜ 0.05)，r值分別為 0.743，0.723，0.730，0.725，0.789，0.788，0.789，0.769。

表1 大鼠血清PCT與TNF-α、IFN-γ、IL-4及內(nèi)毒素水平比較(±s)

表1 大鼠血清PCT與TNF-α、IFN-γ、IL-4及內(nèi)毒素水平比較(±s)

與正常組比較，*P＜0.05

組別PCT(ng/ml)TNF-α(pg/ml)IFN-γ(pg/ml)IL-4(pg/ml)內(nèi)毒素(EU/L)正常組0.025 ±0.008 1.068 ±0.956 12.53 ±0.885 0.096 ±0.401 0.291 ±0.019 ALF組12h 1.114 ±0.053*29.35 ±5.103*26.20 ±0.549*1.333 ±0.142*0.599 ±0.076*24h 3.134 ±0.093*28.45 ±5.17*34.29 ±0.348*1.087 ±0.266*0.849 ±0.008*

表2 兩組大鼠組織PCT水平的比較 (ng/ml)

3 討論

PCT是近年被發(fā)現(xiàn)的一種無活性的降鈣素的前肽物質，由116個氨基酸組成，相對分子質量為13000，血中半衰期約為22～35小時，正常時由甲狀腺的C細胞分泌。正常人體血中PCT水平很低［2］，組織中也存在PCT，以肝、胰、腎等含量相對較高。病理狀態(tài)下肝、脾、胰、肺、腎、小腸等組織也能產(chǎn)生較高的PCT［3］。有文獻報道，PCT是一種炎癥性介質，可作為判斷早期炎性反應的指標［4］。在全身炎癥反應綜合征、多器官功能障礙、敗血癥等嚴重感染時PCT相對于傳統(tǒng)的感染標志物有著持續(xù)時間長，特異性高的優(yōu)點，可以更好地預測病情的嚴重程度，病程的時間［5］。內(nèi)毒素在革蘭氏陰性細菌細胞壁的外層，其主要成分為脂多糖，正常時腸道內(nèi)的內(nèi)毒素被肝臟的枯否氏細胞解毒和清除。但在肝功能損害時，肝臟的枯否氏細胞的吞噬清除能力下降，內(nèi)毒素經(jīng)側支循環(huán)進入體循環(huán)，而形成腸源性內(nèi)毒素血癥。臨床上，腸源性內(nèi)毒素血癥越來越受到重視。肝硬化患者由于腸道微循環(huán)的改變，腸黏膜充血、腫脹，屏障功能降低致使腸黏膜通透性增加，腸道細菌增多向腹腔中移位，并發(fā)腹腔感染。肝功能損害時，內(nèi)毒素作用肝臟后，引起多種細胞因子炎癥介質的釋放，如TNF-α，導致免疫損害，可加重肝功能的損害，易合并細菌感染。可見內(nèi)毒素血癥與肝損害兩者互為因果，關系密切，隨著內(nèi)毒素水平的增加，肝損害的程度亦逐步加重［6］。Dandona等在健康人體內(nèi)注射入小劑量內(nèi)毒素后，于1、2、4、6、8、24小時檢測血漿 PCT水平，在兩小時后可檢測到少量PCT，4～6小時迅速升高，8～24小時達到高峰，2到3天后逐漸恢復到正常水平［7］。在急性胰腺炎時，血清PCT的水平可較早地評估病情的程度。急性壞死性胰腺炎時，血內(nèi)毒素的水平則可提示腸源性感染［8］。據(jù)文獻報道，內(nèi)毒素及細胞因子 TNF-α、IL-6等可能刺激和誘導了PCT的產(chǎn)生［9］。本實驗結果提示，在急性肝衰竭并發(fā)感染時監(jiān)測PCT的水平可以較早地診斷和評估病情。本實驗結果還提示，PCT在急性肝衰竭的發(fā)病中起著重要的作用。在正常組大鼠的肝臟、脾臟、小腸組織中可檢測到PCT，模型組大鼠的肝臟和小腸的PCT含量明顯升高。這可能與肝損害時機體器官功能的改變存在著一定的關系。在肝組織的病理形態(tài)學上，正常組大鼠肝組織肝小葉結構清晰，肝細胞無變性壞死;在模型組大鼠12小時，肝細胞片狀變性、壞死，炎性細胞浸潤，模型組大鼠24小時，肝細胞大片壞死，小葉結構失常，符合臨床上急性肝衰竭患者的病情進展，這也與PCT水平升高的變化程度一致。

由以上結果可看出，PCT在急性肝衰竭的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。急性肝衰竭時，血清和組織中，如肝臟、小腸PCT均升高，可能與肝臟、腸道功能的改變有著一定的關系。PCT的升高對急性肝衰竭時，重癥感染及膿毒血癥的臨床診斷，抗生素的選擇應用可提供參考作用。

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