羅心靜,莫選榮,周玲玲

(臺州學院醫(yī)學院生理學教研室,浙江 臺州 318000)

類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種以累及周圍關節(jié)為主要表現(xiàn)的系統(tǒng)性炎癥性自身免疫病。其病理特征表現(xiàn)為關節(jié)滑膜炎癥及骨質破壞。RA滑膜組織中的滑膜成纖維樣細胞及其分泌的炎癥因子IL-6和IL-8在RA滑膜炎癥及骨質破壞中起到重要作用[1]。熱休克蛋白(heat shock protein,Hsp)72是細胞內含量最豐富的熱休克蛋白,其基本功能起到“分子伴侶”作用。有證據(jù)表明,Hsp72能釋放到細胞外環(huán)境(如血漿、腦脊液)中,可能參與對機體免疫功能的調節(jié)[2]。近年來研究發(fā)現(xiàn)在類風濕關節(jié)炎患者的關節(jié)液中存在高水平的Hsp72[3],但對其在關節(jié)滑膜炎癥中的作用尚不清楚。本研究采用重組的Hsp72處理滑膜成纖維樣細胞,觀察Hsp72對IL-6、IL-8表達及NF-κ B信號通路活化的影響,以探討Hsp72在RA關節(jié)滑膜炎癥中的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 材料

Hsp72重組蛋白(加拿大Stressgen公司;IL-6、IL-8 ELISA試劑盒(RD公司),TNF-α(美國R&D公司),PCNA小鼠單克隆抗體(美國BD Biosciences公司),GAPDH小鼠單克隆抗體、NF-κ B p65兔多克隆抗體、Iκ Bα兔多克隆抗體(美國 Santa Cruz公司),Hoechst 33258(美國Sigma公司),PVDF膜(美國Millipore公司),FITC標記的羊抗兔IgG(美國Sigma公司),DAB顯色試劑盒(中國博士德生物公司)。

1.2 滑膜細胞的分離和培養(yǎng)

將關節(jié)置換術中所取下的新鮮RA患者滑膜組織剪碎,1 mg/ml膠原酶消化2 h,0.2%胰蛋白酶消化30 min。離心收集細胞,加入含 15%FCS的DMEM培養(yǎng)基,在5%CO2,37℃的濕潤條件下貼壁培養(yǎng),當細胞生長至融合時,用0.25%胰蛋白酶消化并按1/3比例分瓶傳代培養(yǎng)。本研究使用滑膜成纖維細胞是 4～8傳代細胞。細胞純度為 95%(CD3、CD11b 、CD14、Von willibr and factor陽性細胞比例均小于1%)。

1.3 實驗分組及處理

將RA滑膜細胞隨機分為4組,對照組:未做任何處理;TNF-α組:單獨用 20 ng/ml TNF-α刺激;Hsp72 組:單獨用 1 μ g/ml Hsp72 孵育;Hsp72+TNF-α組:1 μ g/ml Hsp72預先孵育1h后再加入20 ng/ml TNF-α共孵育。

1.4 細胞因子檢測

收集相應處理后的滑膜細胞培養(yǎng)上清,采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法檢測細胞培養(yǎng)上清中IL-6和IL-8的含量。具體操作按相應試劑盒說明書進行。

1.5 細胞處理和細胞核蛋白及胞漿組分的分離

收集相應處理后的滑膜細胞,預冷的PBS洗滌,1 000×g離心1 min,棄上清,沉淀加入400 μ l預冷的緩沖液A(10 mmol/L HEPES pH 7.9;10 mmol/L KCl;0.1 mmol/L EDTA;0.1 mmol/L;EGTA;1 mmol/L DTT;0.5 mmol/L PMSF)冰上靜置15 min破壞細胞膜,加入25 μ l預冷的 10%NP-40 混勻,渦流振蕩10 s,3 000×g離心5 min,上清即胞漿蛋白組分。沉淀繼續(xù)加入50 μ l預冷的緩沖液B(20 mmol/L HEPES pH 7.9;0.4 mol/L NaCl;1 mmol/L EDTA;1 mmol/L EGTA;1 mmol/L DTT;1 mmol/L PMSF)冰上靜置15 min破壞核膜,4℃下12 000×g離心 10 min,上清即核蛋白組分。

1.6 Western blot分析

將上述收集的上清液用Bradford法測定總蛋白濃度。將 20～30 μ g蛋白與 6×SDS加樣緩沖液(187.5 mmol/L Tris-HCl pH 6.8,6%SDS,30%甘油,150 mmol/L DTT,0.1%溴酚藍)混合,100℃煮沸10 min。樣品經10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后,電轉移法轉移到PVDF膜上。室溫下封閉4 h后,加入相應一抗,4℃過夜。洗去一抗后,加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗,反應 2 h。隨后用DAB顯色,光密度掃描定量分析。

1.7 細胞免疫熒光分析

將滑膜細胞接種于鋪有蓋玻片的六孔板(1.0×105cells/well)中,于37℃,5%CO2濃度的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細胞在玻片上長成單層時,取出玻片,PBS清洗,多聚甲醛固定,0.1%Triton X-100通透20 min,加入2%BSA封閉 30 min,加入一抗,4℃過夜,洗去一抗后,加 cy3標記的二抗,孵育45 min,加Hoechst33258孵育2min,雙蒸水清洗5min,吸干,中性樹膠封片,熒光顯微鏡分析。

1.8 統(tǒng)計分析

2 結果

2.1 Hsp72對IL-6和IL-8表達的影響

ELISA結果顯示,TNF-α刺激滑膜胞細24 h后,IL-6和IL-8分泌增多,單獨的Hsp72處理24 h對IL-6和IL-8的分泌并無明顯影響,但Hsp72預處理1 h能顯著降低TNF-α所致滑膜成纖維細胞IL-6和IL-8的分泌(表1)。

Tab.1 Effects of Hsp72on the expression of IL-6 and IL-8 in RA synoviocytes induced by TNF-α(ng/ml, ±s,n=6)

Tab.1 Effects of Hsp72on the expression of IL-6 and IL-8 in RA synoviocytes induced by TNF-α(ng/ml, ±s,n=6)

*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs TNF-αgroup

Group IL-6 IL-8 Control 5.2±0.6 2.6±0.7 Hsp72 4.8±0.9 2.3±0.8 TNF-α 17.0±3.8* 6.5±1.5*Hsp72+TNF-α 5.5±1.3# 4.6±1.1#

2.2 Hsp72對NF-κ B(p65)表達的影響

Western blot結果顯示,正常對照組中,p65-NF-κ B在滑膜細胞核中表達很少,而在胞漿中表達較多;TNF-α刺激 30 min后,p65-NF-κ B在細胞核中表達明顯增多,而在胞漿中表達明顯減少;而Hsp72預處理能明顯使TNF-α誘導p65-NF-κ B在細胞核中表達減少,而在胞漿中表達增多(圖1)。

Fig.1 Hsp72 inhibitsTNF-α-induced nuclear translocation of NF-κ B detected by Western blot

2.3 Hsp72對NF-κ B(P65)核移位的影響

免疫熒光細胞化學技術顯示,正常狀態(tài)下,NF-κ B(p65)位于滑膜細胞漿中,滑膜細胞受TNF-α刺激30 min后,NF-κ B(p65)入核明顯增多;Hsp72預處理抑制了對TNF-α誘導的NF-κ B(p65)核移位(圖2)。

Fig.2 Hsp72 inhibits TNF-α-induced nuclear translocation of NF-κ B detected by immunocytochemistry(Immunofluorescence staining×200)

2.4 Hsp72對 TNF-α誘導所致I κ Bα降解的影響

Western blot結果顯示,TNF-α刺激20 min左右,滑膜細胞中Iκ B明顯減少,而Hsp72預處理能顯著抑制 TNF-α誘導 Iκ B 降解 ,使細胞中 Iκ B 增多(圖3)。

Fig.3 Hsp72 inhibits TNF-α-induced degradation ofI κ Bα

3 討論

RA的發(fā)病機制目前尚未完全闡明,但是滑膜細胞及其分泌的細胞因子在RA滑膜炎癥及骨質破壞中起到重要作用。研究表明,滑膜細胞受到炎癥因子(如TNF-α)刺激時能表達和分泌多種促炎細胞因子,其中 IL-6和IL-8在 RA關節(jié)病變中起重要作用[1]。IL-6不僅能促進T細胞和B細胞的增殖和活化,調節(jié)急性期反應蛋白的表達,并且能促進多種炎癥介質的生成[4]。IL-8是一種重要的趨化細胞因子,它能夠引起血漿中性粒細胞、單核細胞和淋巴細胞的滲出,促使這些炎細胞向炎癥部位募集,在RA滑膜炎癥發(fā)生發(fā)展中起重要作用[5]。

Hsp72是細胞內重要的應激蛋白,參與新生蛋白折疊和轉移,在細胞內源性保護中具有重要作用。近些年研究表明,當細胞遭受各種刺激時Hsp72能被表達到細胞膜上或被釋放到細胞外液中[6]。目前認為,細胞外Hsp72可作為細胞受損的一種“危險信號”,調節(jié)機體的固有免疫或適應性免疫反應。大量實驗發(fā)現(xiàn),重組Hsp72能促進單核/巨噬細胞、樹突狀細胞(DC)、血管內皮細胞合成和釋放促炎因子和趨化因子 ,如一氧化氮(NO)、TNF-α、IL-1、IL-6 等 ,發(fā)揮促炎功能[7]。但也有學者發(fā)現(xiàn),重組Hsp72能誘導抗炎細胞因子 IL-10的生成,從而發(fā)揮抗炎效應[8]。最近有報道,與骨關節(jié)炎(OA)患者相比,RA患者關節(jié)液中Hsp72含量顯著升高,提示細胞外Hsp72可能參與RA的關節(jié)炎癥。但細胞外Hsp72在RA炎癥中的作用目前尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn),雖然Hsp72單獨處理對RA滑膜細胞IL-6、IL-8分泌并無顯著影響,但能明顯抑制TNF-α誘導的IL-6、IL-8分泌。這些研究表明,細胞外Hsp72對RA可能具抗炎作用。

NF-κ B通路是調節(jié)炎癥反應的一條重要信號轉導通路。轉錄因子NF-κ B在轉錄水平參與許多炎癥介質基因的表達調節(jié),是引起感染性疾病和自身免疫性疾病發(fā)生發(fā)展的重要機制之一[9]。哺乳動物轉錄因子NF-κ B主要是p65和p50亞家族蛋白結合形成的異二聚體。當細胞未受刺激時,NF-κ B與其抑制蛋白I κ B結合,以無活性的復合物形式存在于細胞漿中。當細胞受到炎性刺激時,I κ B被激活,隨后發(fā)生磷酸化而降解。NF-κ B游離出來后活性恢復,然后移位進入細胞核。在細胞核內,NF-κ B與相應的靶基因啟動子區(qū)的κ B位點相結合促使炎癥介質基因的表達。研究表明,與骨關節(jié)炎相比,NF-κ B在RA滑膜組織中表達明顯升高,而且體外實驗也發(fā)現(xiàn)滑膜細胞遭受炎癥因子刺激時NF-κ B活性增強[10]。為了闡明Hsp72抑制TNF-α所致的滑膜成纖維細胞IL-6、IL-8生成的機制,本研究觀察Hsp72對TNF-α誘導的NF-κ B通路活化的影響。本研究顯示,Hsp72能夠明顯減少TNF-α誘導的I κ B降解,并且能抑制NF-κ B的核移位,表明Hsp72能抑制RA滑膜細胞NF-κ B信號通路的活化而抑制炎癥因子的產生和分泌。

總之,Hsp72下調了RA滑膜細胞IL-6、IL-8的產生和分泌,以及抑制NF-κ B信號通路的活化,提示細胞外Hsp72對RA可能具有抗炎作用。

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