邱紅梅，賴舒，尚京川，周岐新#（.重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理教研室/重慶市生物化學(xué)與分子藥理學(xué)重點實驗室，重慶 40006；重慶醫(yī)科大學(xué)藥物分析教研室，重慶 40006）

石榴皮是石榴科植物石榴（Punica granatunL）的干燥果皮，其主要成分為石榴皮鞣質(zhì)，占10.4%～21.3%。石榴皮性溫，味澀，入肺、腎、結(jié)腸經(jīng)，具有生津止渴、澀腸、止血等功效[1，2]。有研究證明，石榴皮的提取物對多種原因引起的消化系統(tǒng)潰瘍有保護(hù)作用。石榴皮提取物可抑制大鼠幽門結(jié)扎型胃潰瘍的形成[3]；也對大鼠阿司匹林和乙醇誘導(dǎo)的實驗性胃黏膜損傷和結(jié)腸炎有保護(hù)作用[4]，但其作用機(jī)制尚未見報道。為此，本研究采用丙酮提取和乙酸乙酯萃取法獲得石榴皮鞣質(zhì)，觀察其對大鼠乙醇性胃黏膜損傷的保護(hù)作用并對其作用機(jī)制進(jìn)行研究。

1 儀器與材料

1.1 儀器

SZ297型自動三重純水蒸餾器（上海亞榮生化儀器廠）；保溫干燥箱（重慶實驗設(shè)備廠）；A2000S型電子分析天平（德國Sartorius公司）；721型分光光度計（上海第三分析儀器廠）；SN-695型智能γ-計數(shù)器（上海核福光電儀器有限公司）；－70℃低溫冰箱（德國Forma Scientic公司）；3K30型低溫離心機(jī)（德國Sigma公司）；UV265紫外-可見分光光度計（日本島津公司）；BH-2型光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）；CM-2000B型生物醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)（北京航天航空大學(xué)）。

1.2 試藥

干燥石榴皮（批號：070911），購自徐州醫(yī)藥有限公司中藥飲片廠，由重慶醫(yī)科大學(xué)化學(xué)教研室尚京川教授參照丙酮提取、醋酸乙酯萃取法從石榴皮中提取鞣質(zhì)，總鞣質(zhì)含量為73%[5]；枸櫞酸鉍鉀（麗珠集團(tuán)麗珠制藥廠，批號：070906）；一氧化氮（NO）、丙二醛（MDA）測試盒（南京建成生物工程研究所）；多聚賴氨酸、兔抗一氧化氮合酶（NOS）1多克隆抗體、兔抗NOS2多克隆抗體、兔抗NOS3多克隆抗體、即用型SABC免疫組化試劑盒（武漢博士德生物工程公司）。

1.3 動物

清潔級SD大鼠，♀♂兼半，體重180～230g，由重慶醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供（動物使用合格證號：SCXK（渝）20020001）。

2 方法

2.1 復(fù)制模型和分組、給藥

實驗分為6組，即正常（等容生理鹽水）、模型（等容生理鹽水）、枸櫞酸鉍鉀（100mg·kg－1）和石榴皮鞣質(zhì)高、中、低劑量（500、150、50mg·kg－1）組。ig給藥，給藥體積為0.01mL·g－1，給藥2h后除正常組外其余各組均ig無水乙醇1.5mL/只以復(fù)制幽門結(jié)扎型胃潰瘍大鼠模型。

2.2 觀察指標(biāo)

2.2.1 胃黏膜潰瘍指數(shù)的觀察 ig無水乙醇1h后，處死大鼠，打開腹腔并結(jié)扎賁門和幽門，向胃腔內(nèi)注入1%甲醛溶液2mL后，取出胃并立即浸泡于1%甲醛中5min，然后用清水漂洗胃體，10min后按照Main and Whittle方法[4]直接測量胃部潰瘍面積，觀察并記錄潰瘍得分?jǐn)?shù)：潰瘍長度為≤1、1～2、2～3mm時分?jǐn)?shù)分別為1、2、3。將記錄總分除以10得潰瘍指數(shù)，并按下列公式計算潰瘍抑制率：潰瘍抑制率＝（模型組潰瘍指數(shù)－給藥組潰瘍指數(shù)）/模型組潰瘍指數(shù)×100%。

2.2.2 胃黏膜病理形態(tài)學(xué)的觀察 ig無水乙醇1h后，處死大鼠，打開腹腔并結(jié)扎賁門和幽門，向胃腔內(nèi)注入1%甲醛溶液2mL后，取出胃，從胃竇至胃體取下一條狀胃組織，置于10%福爾馬林液中固定6～8h，乙醇梯度脫水，常規(guī)石蠟包埋切片（切片厚約4μm），HE染色，光鏡下進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)觀察。保存切片供免疫組化分析用。

2.2.3 胃黏膜NO和MDA含量的檢測 將“2.2.2”項下取完條狀組織后余下鼠胃，于冰浴上用濾紙吸干，迅速刮取胃黏膜，于－70℃貯藏，備用。稱重，用冰生理鹽水制成10%胃黏膜組織勻漿。4℃下2000r·min－1離心8min，取上清液，按試劑盒說明書進(jìn)行NO、MDA測定。

2.2.4 胃黏膜神經(jīng)元型（n）NOS、內(nèi)皮型（e）NOS表達(dá)的檢測 取石蠟切片常規(guī)脫蠟脫水；切片滴加3%H2O2液，室溫孵育10min，滅活內(nèi)源性過氧化物酶；蒸餾水沖洗，PBS浸泡5min；將切片浸入0.01mol·L－1枸櫞酸鹽緩沖液（pH 6.0）中，電爐加熱至沸騰后斷電，間隔10min，反復(fù)上述操作2次，冷卻；PBS沖洗3min×3次；滴加抗原修復(fù)液Ⅰ于切片上，室溫10min后PBS沖洗3min×3次；滴加正常山羊血清封閉液，室溫20min，甩去多余液體，不洗；分別滴加兔抗NOS1多克隆抗體、兔抗NOS2多克隆抗體（稀釋度為1∶100），4℃過夜；PBS沖洗5min×5次；滴加生物素化山羊抗鼠IgG，37℃孵育20min；PBS沖洗5min×3次；滴加試劑SABC，37℃孵育20min；PBS沖洗5min×4次；滴加DAB在室溫下顯色，鏡下控制反應(yīng)時間，出現(xiàn)棕黃色顆粒時即用蒸餾水沖洗終止反應(yīng)；50℃條件下脫水，用二甲苯透明，中性樹膠封片；光鏡下觀察nNOS、eNOS蛋白分布；采用生物醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)分析，每張切片取2個視野，在10×20倍視野下測面積陽性積分光密度，并以其代表nNOS、eNOS蛋白含量。

2.3 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 胃黏膜潰瘍指數(shù)與潰瘍抑制率

與模型組比較，石榴皮鞣質(zhì)高、中劑量組大鼠胃潰瘍指數(shù)顯著降低（P＜0.01），潰瘍抑制率顯著增加（P＜0.01）。石榴皮鞣質(zhì)對模型大鼠胃黏膜的影響見表1、圖1。

表1 石榴皮鞣質(zhì)對模型大鼠胃黏膜的影響（±s，n＝8）Tab 1 Effects of tannins from P.granatum on gastric mucosa in model rats（±s，n＝8）

表1 石榴皮鞣質(zhì)對模型大鼠胃黏膜的影響（±s，n＝8）Tab 1 Effects of tannins from P.granatum on gastric mucosa in model rats（±s，n＝8）

與正常組比較：＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.01vs.normal group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.01

潰瘍抑制率/%組別正常組模型組石榴皮鞣質(zhì)低劑量組石榴皮鞣質(zhì)中劑量組石榴皮鞣質(zhì)高劑量組枸櫞酸鉍鉀組潰瘍指數(shù)/級-10.92±1.21＊9.77±2.532.71±1.11#0.24±0.12#0.16±0.07#- 011.075.0#97.8#98.5#

3.2 胃黏膜病理組織切片觀察

HE染色后，光鏡下觀察可見正常組大鼠胃黏膜層厚薄均勻，組織結(jié)構(gòu)層次清楚，上皮完整，連續(xù)性好，腺體排列整齊，無充血現(xiàn)象；模型組大鼠乙醇所致胃黏膜損傷雖未累及黏膜肌層，但可見黏膜灶狀糜爛出血，上皮細(xì)胞受損破壞，黏液腺脫落，上皮與固有層分離，腺體結(jié)構(gòu)破壞甚至凝固性壞死，核固縮，固有層毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，且見中性粒細(xì)胞、少量淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和漿細(xì)胞等急、慢性炎癥細(xì)胞浸潤；而枸櫞酸鉍鉀和石榴皮鞣質(zhì)高劑量組大鼠胃黏膜未見明顯損傷，上皮細(xì)胞偶有損傷亦較輕微，僅見毛細(xì)血管擴(kuò)張充血、炎性分泌物、少量壞死組織和纖維蛋白。石榴皮鞣質(zhì)對模型大鼠損傷性胃黏膜病理形態(tài)學(xué)影響見圖2。

圖1 石榴皮鞣質(zhì)對模型大鼠胃黏膜的影響A.模型組；B.石榴皮鞣質(zhì)低劑量組；C.石榴皮鞣質(zhì)中劑量組；D.石榴皮鞣質(zhì)高劑量組；E.枸櫞酸鉍鉀組Fig 1 Effects of tannins from P.granatum on gastric mucosa in model ratsA.model group；B.tannins from P.granatum low-dose group；C.tannins from P.granatum medium-dose group；D.tannins from P.granatum high-dose group；E.colloidal bismuth subcitrate group

3.3 胃黏膜MDA、NO含量檢測

與正常組比較，模型組MDA含量顯著升高，NO含量顯著降低（P＜0.01）。與模型組比較，石榴皮鞣質(zhì)高、中劑量組MDA含量顯著降低，NO含量顯著升高（P＜0.01或P＜0.05）。石榴皮鞣質(zhì)對模型大鼠胃黏膜NO和MDA含量的影響見表2。

3.4 胃黏膜nNOS、eNOS表達(dá)水平分析

免疫組化分析顯示，正常組nNOS、eNOS在胃組織廣泛分布。與正常組比較，模型組nNOS、eNOS在胃組織的分布與正常大鼠一致，但表達(dá)量均顯著降低（P＜0.01或P＜0.05）。與模型組比較，石榴皮鞣質(zhì)高、中、低劑量組nNOS、eNOS在胃黏膜的表達(dá)有減弱趨勢，但無顯著性差異。石榴皮鞣質(zhì)對模型大鼠胃黏膜nNOS、eNOS表達(dá)的影響見表3。

圖2 石榴皮鞣質(zhì)對模型大鼠損傷性胃黏膜病理形態(tài)學(xué)影響（HE染色，200×）A：正常組；B：模型組；C：石榴皮鞣質(zhì)高劑量組；D：枸櫞酸鉍鉀組Fig 2Effect of pathomorphology of tannins from P.granatum on gastric mucosa in model rats（HE staining，200×）A.normal group；B.model group；C.tannins from P.granatum highdose group；D.colloidal bismuth subcitrate group

表2 石榴皮鞣質(zhì)對模型大鼠胃黏膜NO和MDA含量的影響（±s，n＝8）Tab 2Effects of tannins from P.granatum on the contents of NO and MDAin gastric mucosa in rats（±s，n＝8）

表2 石榴皮鞣質(zhì)對模型大鼠胃黏膜NO和MDA含量的影響（±s，n＝8）Tab 2Effects of tannins from P.granatum on the contents of NO and MDAin gastric mucosa in rats（±s，n＝8）

與正常組比較：＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01vs.normal group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05，##P＜0.01

NO 含量/μmo l·g－1 1.42±0.230.57±0.15＊0.62±0.240.80±0.24#1.24±0.42#1.73±0.14##組別正常組模型組石榴皮鞣質(zhì)低劑量組石榴皮鞣質(zhì)中劑量組石榴皮鞣質(zhì)高劑量組枸櫞酸鉍鉀組M D A 含量/n mo l·mg－1 1.25±0.513.65±0.93＊3.11±1.372.26±0.95#1.52±0.56##1.61±0.47##

表3 石榴皮鞣質(zhì)對模型大鼠胃黏膜nNOS、eNOS表達(dá)的影響（±s，n＝8）Tab 3 Effects of tannins from P.granatum on nNOS and eNOS expression in gastric mucosa in rats（±s，n＝8）

表3 石榴皮鞣質(zhì)對模型大鼠胃黏膜nNOS、eNOS表達(dá)的影響（±s，n＝8）Tab 3 Effects of tannins from P.granatum on nNOS and eNOS expression in gastric mucosa in rats（±s，n＝8）

與正常組比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vs.normal group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別正常組模型組石榴皮鞣質(zhì)低劑量組石榴皮鞣質(zhì)中劑量組石榴皮鞣質(zhì)高劑量組n NO S光密度/μm2 0.79±0.110.45±0.09＊＊0.39±0.040.56±0.050.58±0.05e NO S光密度/μm2 0.59±0.080.37±0.04＊0.36±0.050.43±0.070.49±0.03

4 討論

胃潰瘍是一種嚴(yán)重危害人類健康的常見病、多發(fā)病，酒精性胃黏膜損傷是常見的發(fā)病原因之一。本研究采用ig無水乙醇復(fù)制酒精性胃潰瘍模型。結(jié)果表明，預(yù)先給予石榴皮鞣質(zhì)能顯著減輕乙醇引起的胃黏膜損傷，提示石榴皮鞣質(zhì)是防治酒精性胃黏膜損傷的有效候選藥物。

胃腸黏膜在化學(xué)物質(zhì)、缺血或細(xì)胞能量不足等情況下可產(chǎn)生大量的氧自由基，氧自由基在整體水平和細(xì)胞水平都可以引起胃黏膜或黏膜細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致胃黏膜血流障礙，引發(fā)胃黏膜損傷[6]。本研究表明，乙醇損傷性胃黏膜組織中MDA含量明顯升高，提示脂質(zhì)過氧化反應(yīng)參與了大鼠乙醇性胃黏膜損傷的病理、生理過程。預(yù)先ig石榴皮鞣質(zhì)可明顯抑制模型大鼠胃黏膜MDA含量升高，提示其減少自由基生成、降低抗脂質(zhì)過氧化反應(yīng)可能與其胃黏膜保護(hù)作用密切相關(guān)。

NO是胃腸道非膽堿能非腎上腺素能神經(jīng)所釋放的一種神經(jīng)介質(zhì)和信使分子，由NOS催化生成。正常分泌的NO可能通過增加胃黏膜血流量[7]，維持胃黏膜上皮的完整性，參與黏膜損傷后的保護(hù)與修復(fù)[7，8]，抑制炎性細(xì)胞的趨化和黏附[9～12]等途徑發(fā)揮胃黏膜保護(hù)作用。國內(nèi)、外研究報道，NOS的抑制劑NG-硝基-L-精氨酸可加重酒精所致的胃黏膜損傷，提出胃黏膜NO含量的下降與胃潰瘍的發(fā)生有直接關(guān)系[13～16]。本研究表明，乙醇性急性胃黏膜損傷模型大鼠的胃黏膜組織內(nèi)NO含量明顯降低，預(yù)先給予石榴皮鞣質(zhì)能顯著阻遏NO水平下降，提示胃黏膜組織內(nèi)NO含量降低可能參與了模型大鼠乙醇性急性胃黏膜損傷的病理過程，而石榴皮鞣質(zhì)的抗損傷作用與其阻遏NO水平下降有關(guān)。

在此基礎(chǔ)上，筆者進(jìn)一步研究了石榴皮鞣質(zhì)阻遏NO水平下降的機(jī)制。機(jī)體內(nèi)NO含量的高低主要是由NOS調(diào)控的。胃黏膜的NOS主要分為兩大類，即依賴Ca2+的固有型NOS（cNOS，包括nNOS和eNOS）和不依賴Ca2+的誘導(dǎo)型NOS（iNOS）。cNOS主要分布于神經(jīng)元和內(nèi)皮細(xì)胞，具有穩(wěn)定的活性，持續(xù)釋放少量NO而發(fā)揮保護(hù)胃黏膜的作用。有報道稱，水拘禁應(yīng)激性胃潰瘍的發(fā)生與胃黏膜nNOS和eNOS的過度抑制密切相關(guān)。本研究表明，與正常大鼠胃黏膜比較，乙醇損傷性胃黏膜組織內(nèi)nNOS和eNOS的分布無明顯差異，但其表達(dá)顯著降低，提示胃黏膜nNOS和eNOS的變化參與了乙醇性胃黏膜損傷；預(yù)先給予石榴皮鞣質(zhì)有阻遏nNOS和eNOS的表達(dá)下降的趨勢，但未見顯著性差異。

綜上所述，本研究證明石榴皮鞣質(zhì)具有防治乙醇性胃損傷作用，此作用可能與降低抗脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、阻遏胃黏膜nNOS和eNOS的表達(dá)下降，調(diào)控NO含量在正常水平有關(guān)。

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