劉 武，肖 牧，阮 穎，劉春林

(1湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)沙410128;2湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，長(zhǎng)沙410128;3作物種質(zhì)創(chuàng)新和資源利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，長(zhǎng)沙410128)

MYC2是一類含有helix－loop－h(huán)elix(bHLH)結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，在擬南芥中能夠激活或抑制茉莉酸 (JA)信號(hào)途徑的相關(guān)基因表達(dá)［1］。Berger等［2］研究發(fā)現(xiàn)，MYC2 是 JAI1/JIN1(JASMONATE－INSENSITIVE1)的等位基因，能降低擬南芥植株根部對(duì)外源JA的敏感性。已有研究表明，MYC2不僅在JA信號(hào)傳導(dǎo)途徑中起著十分重要的作用［3］，而且在JA信號(hào)途徑與其他激素信號(hào)途徑的相互作用中也起著重要的作用，能夠正調(diào)控依賴于脫落酸 (ABA)途徑的植物的抗旱反應(yīng)以及參與由假單孢桿菌誘導(dǎo)的依賴于水楊酸 (SA)途徑的防御反應(yīng)［4］。此外，MYC2也能正調(diào)控JA或創(chuàng)傷反應(yīng)基因VSP，LOX和TAT的表達(dá)，提高植株的抗性［1，5，6］。

但至今為止對(duì)由MYC2調(diào)控的相關(guān)基因的報(bào)道依舊很少。現(xiàn)已知，MYC2能負(fù)調(diào)控 PDF1.2，CHIB/PR3 和HEL/PR4 等 基 因 的 表 達(dá)［1，7］，但myc2/jin1突變體植株卻對(duì)一系列病原菌(Plectosphaerellacucumerina，Botrytiscinerea，F(xiàn)usarium oxysporum)表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗性。為了進(jìn)一步研究MYC2因子在植物防御抗性中的作用以及其參與植物JA，SA等信號(hào)途徑的作用機(jī)制，筆者利用特異性引物擴(kuò)增了擬南芥植株中的MYC2基因，并以此構(gòu)建了pGBKT7_MYC2酵母雙雜交載體，為利用酵母雙雜交技術(shù)尋找與 MYC2轉(zhuǎn)錄因子相互作用的蛋白及構(gòu)建MYC2蛋白互作圖譜打下了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 主要試劑

限制性內(nèi)切酶PstI，SmaI，T4 DNA連接酶，PCR Mix等工具酶購(gòu)自Fermentas公司;瓊脂糖(Agarose)購(gòu)自長(zhǎng)沙維爾公司;LongAmp Taq DNA polymerase購(gòu)自NEB公司;PMD19－T載體購(gòu)自大連Takara公司;質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自 Axygen公司;柱式 DNA膠回收試劑盒DNA、標(biāo)準(zhǔn)分子量Marker購(gòu)自康維世紀(jì)公司;酵母用培養(yǎng)基購(gòu)自Sigma公司;Western blot所需試劑購(gòu)自 Millipore公司;其他常用試劑均為分析純，購(gòu)自上海國(guó)藥。

1.1.2 菌株及質(zhì)粒

大腸桿菌DH5，由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物代謝調(diào)控實(shí)驗(yàn)室保存;酵母菌株 (Glod菌株)、表達(dá)載體pGBKT7、pGBKT7_CLF融合蛋白等由中國(guó)科學(xué)院上海植物生理生態(tài)研究所黃海課題組提供。

1.2方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)Genebank上的基因序列，應(yīng)用引物設(shè)計(jì)軟件primer premier 5，結(jié)合酵母表達(dá)載體 pGBKT7的讀框、多克隆位點(diǎn)，分別在上下游引物5'端插入相應(yīng)的酶切位點(diǎn)SmaI及PstI。引物序列如下:

MYC2－F:5'－ CCCGGGATGACTGATTACCGGCTACAA－3';

MYC2－R:5'－CTGCAGTTAACCGATTTTTGAAATCAAACTT－ 3'。

1.2.2 誘餌載體構(gòu)建示意圖

載體選用pGBKT7表達(dá)載體，將克隆的MYC2全長(zhǎng)CDS插入其多克隆位點(diǎn)。

圖1 pGBKT7_MYC2載體構(gòu)建示意圖

1.2.3 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系

反應(yīng)體系總體積:30 μL;無菌超純水:20 μL;Buffer:6 μL; 引 物 (10 μmol/L): 各 1.2 μL;long Taq(2.5 μmol/L):1.2 μL;dNTP(10 mmol/L):0.9 μL; 模板 cDNA(100 ng):1 μL(擬南cDNA)。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)參數(shù):94℃預(yù)變性30 s，94℃變性10 s，56℃退火50 s，65℃延伸90 s，共30個(gè)循環(huán)，最后65℃終延伸10 min，PCR產(chǎn)物4℃保存。

1.2.3 T載體連接及大腸桿菌轉(zhuǎn)化

T載體連接具體操作參考Takara公司試劑盒。連接產(chǎn)物采用熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌。選取菌落PCR檢測(cè)為陽性的菌液，測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.4 誘餌載體構(gòu)建

用限制性內(nèi)切酶PstI，SmaI對(duì)擴(kuò)增的MYC2片段和表達(dá)載體pGBKT7進(jìn)行酶切，回收基因片段和表達(dá)載體片段 (具體操作參見Fermentas公司試劑盒說明)。連接轉(zhuǎn)化后，挑取陽性克隆提取質(zhì)粒用雙酶切鑒定。

1.3 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母菌株

1.3.1 制備酵母感受態(tài)細(xì)胞

誘餌載體轉(zhuǎn)化的酵母株是Gold，采用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法 (具體操作參見clontech公司酵母操作手冊(cè))。

1.3.2 轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞

將構(gòu)建好的誘餌載體、鮭魚精DNA和酵母感受態(tài)細(xì)胞混合，加入0.7 mL PEG/LiAc溶液振蕩混勻。30℃振蕩培養(yǎng)30 min，加入0.07 mL DMSO混勻，在42℃水浴15 min，冰浴10 min，離心，棄上清，以1.5 mL 1×TE重懸細(xì)胞后，鋪于SD/－Trp平板。

1.4 Western blotting技術(shù)檢測(cè)pGBKT7_MYC2誘餌蛋白表達(dá)

參照clontech公司的酵母手冊(cè)操作，先進(jìn)行酵母蛋白的提取。提出蛋白后，進(jìn)行SDS－PAGE電泳，濕轉(zhuǎn)100 V，1.5 h，封閉后加一抗 (c－myc)過夜，二抗 (羊抗鼠，1 h)，洗滌后采用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)目的蛋白條帶。

2 結(jié)果與分析

2.1 擬南芥MYC2基因的PCR擴(kuò)增

根據(jù)引物的退火溫度，設(shè)計(jì)溫度梯度PCR，確定最佳的退火溫度為60℃。以60℃為退火溫度進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出了1 880 bp左右的條帶，擴(kuò)增片段大小與預(yù)期大小一致 (圖2)。

圖2 longAmp酶擴(kuò)增得到MYC2全長(zhǎng)CDS

2.2 MYC2全長(zhǎng)CDS片段連T－Vector及轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α

圖3 菌落PCR檢測(cè)陽性菌落

將擴(kuò)增出的1 880 bp左右的目的帶進(jìn)行切膠回收，用T4連接酶將回收片段連接到pMD19－T載體，熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5的感受態(tài)細(xì)胞，取100 mL菌液涂到LB固體培養(yǎng)基上 (含有氨芐青霉素50 g/mL)生長(zhǎng)，隨機(jī)挑選數(shù)個(gè)單菌落進(jìn)行PCR檢測(cè) (圖3)，以獲得陽性克隆。

挑選驗(yàn)證正確后的克隆測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示去除酶切位點(diǎn)后序列長(zhǎng)度為1 872 bp，與已發(fā)表的擬南芥MYC2全長(zhǎng)CDS的序列一致，所克隆的序列是目的基因的全長(zhǎng)CDS序列。

2.3 誘餌蛋白載體酶切檢測(cè)

將測(cè)序正確的MYC2片段與酵母雙雜交誘餌載體pGBKT7經(jīng)PstI，SmaI雙酶切后，用T4連接酶連接，構(gòu)建酵母雙雜交誘餌載體pGBKT7_MYC2。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌得到陽性克隆后，進(jìn)行酶切驗(yàn)證 (圖4)，結(jié)果顯示出現(xiàn)了約1 880 bp的目的片段。

圖4 pGBKT7_MYC2質(zhì)粒酶切結(jié)果

2.4 誘餌蛋白載體轉(zhuǎn)化酵母菌

將經(jīng)過酶切驗(yàn)證正確后的pGBKT7_MYC2誘餌蛋白表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到宿主菌Glod菌中，熱激轉(zhuǎn)化后將轉(zhuǎn)化液均勻涂抹于 SD/－Trp培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)2～3 d后，觀察平板上酵母菌的生長(zhǎng)情況。(圖5)

圖5 含目的蛋白重組質(zhì)粒的Gold菌在SD/－Trp上的生長(zhǎng)情況

2.5pGBKT7_MYC2誘餌蛋白表達(dá)載體自激活檢測(cè)

將pGBKT7_MYC2質(zhì)粒與pGADT7空質(zhì)粒共轉(zhuǎn)酵母Glod先后在SD/－LT和SD/－HLTA上進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)僅對(duì)照組長(zhǎng)出了正常菌落 (圖6)，表明pGBKT7_MYC2誘餌蛋白表達(dá)載體不存在自激活。

圖6 pGBKT7_MYC2載體的酵母自激活檢測(cè)結(jié)果

2.6pGBKT7_MYC2誘餌蛋白的表達(dá)

通過Western blotting分析表達(dá)質(zhì)粒pGBKT7_MYC2融合蛋白的表達(dá)情況 (圖7)，經(jīng)化學(xué)發(fā)光后顯影，可見約70 000的特異性條帶，大小與預(yù)期結(jié)果一致，說明pGBKT7_MYC2質(zhì)粒能夠在Gold菌中穩(wěn)定表達(dá)。

圖7 誘餌質(zhì)粒表達(dá)蛋白Western blotting檢測(cè)結(jié)果

3討論

植物在受到各種生物性脅迫以及非生物性脅迫后，會(huì)釋放出水楊酸、茉莉酸、乙烯 (ethylene，ET)和脫落酸等信號(hào)分子［8］，其中茉莉酸類物質(zhì)不僅能使植物針對(duì)生物性脅迫以及非生物性脅迫做出特異性反應(yīng)，還對(duì)植物的生長(zhǎng)和發(fā)育有重要的調(diào)控作用［9～12］。對(duì)茉莉酸途徑的研究發(fā)現(xiàn)，MYC2基因是茉莉酸信號(hào)途徑中的關(guān)鍵組分之一［13，14］。雖然MYC2基因不能調(diào)控所有JA介導(dǎo)的信號(hào)途徑分支，卻是已知的唯一一個(gè)JAZ抑制子的靶標(biāo)基因［15，16］。

酵母雙雜交系統(tǒng)是一種具有高靈敏度的研究蛋白之間相互作用的技術(shù)［17］。根據(jù)酵母基因轉(zhuǎn)錄的特性，將編碼DNA－BD的基因與已知蛋白質(zhì)Bait protein的基因構(gòu)建在同一個(gè)表達(dá)載體上，將編碼AD的基因和cDNA文庫的基因構(gòu)建在AD－LIBRARY表達(dá)載體上，當(dāng)上述兩種載體所表達(dá)的融合蛋白能夠相互作用時(shí)，功能重建的反式作用因子能夠激活酵母基因組中的報(bào)告基因。

本實(shí)驗(yàn)利用基因重組的技術(shù)將從擬南芥中克隆到的MYC2全長(zhǎng)CDS構(gòu)建到酵母表達(dá)載體pGBKT7中，構(gòu)建了一個(gè)可用于下一步酵母篩庫所需的誘餌蛋白載體，為以后進(jìn)行酵母篩庫以及酵母雙雜交獲得MYC2蛋白的互作因子以及了解MYC2蛋白的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)奠定了試驗(yàn)基礎(chǔ)，有利于進(jìn)一步了解MYC2蛋白以及JA信號(hào)網(wǎng)絡(luò)在植物中的調(diào)控機(jī)制。

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